2022 Fiscal Year Annual Research Report
中性子単結晶構造解析よるノイラミニダーゼの強い水素結合の観測と反応機構解明
| Project/Area Number |
20K06572
|
|---|
| Research Institution | Ibaraki University |
|---|
Principal Investigator |
山田 太郎 茨城大学, フロンティア応用原子科学研究センター, 産学官連携准教授 (40455910)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 中性子タンパク質結晶構造解析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では酵素反応に関わる重要な部分(活性部位)の構造がインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼと類似するネズミチフス菌由来ノイラミニダーゼについて中性子を用いた結晶構造解析を行うことにより、活性部位を構成するアミノ酸残基の水素イオンの有無(プロトン化状態)を可視化して、反応機構や薬剤の結合状態を明らかにすることを目的としている。2020年度に反応開始状態のノイラミニダーゼの中性子結晶構造解析を行う予定であったが、解析した結果、活性部位にpH緩衝剤と結晶化剤が結合していた。2021年度は酵素反応の中間状態を模した阻害剤薬剤DANA複合体の中性子結晶構造解析を予定通り実施し、DANAの結合に関わる全ての水素結合を明瞭に観察することに成功した。2022年度は当初目標の達成のためにフリー型ノイラミニダーゼの中性子結晶構造解析を行う予定であった。しかし、タンパク質精製の際に必要な特別なタグ切断酵素が入手できなくなり断念せざるを得なかった。そこで2020年度に得られたフリー型に近い状態の中性子回折データを基に重要グルタミン酸残基のプロトン化状態の再評価を行った。茨城県生命物質構造解析装置(iBIX)を使って得られた10日間分の中性子回折Rawデータを1, 2, 4, 6, 8, 10日分に切断し、それぞれのデータセットを自作プログラムによりデータ処理した後、中性子結晶構造解析を行った。2020年度に一部がプロトン化していると予想した重要グルタミン酸残基のプロトン化状態は1~4日間のデータセットを使用した場合は不明瞭であったが、6~10日分のデータセットを使用した場合、非常に弱いプロトン化状態が再現して確認された。このことよりノイラミニダーゼの酵素反応では重要グルタミン酸残基の大部分はプロトン化されておらず、基質の水酸基プロトンを引き抜く能力を有することを明らかにした。
|
