2020 Fiscal Year Research-status Report
Residual Structures of Denatured Proteins Studied by Two-Dimensional NMR Using a Spin-Desalting Column
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20K06574
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
桑島 邦博 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 名誉教授 (70091444)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 晃一 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 教授 (20211849)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 蛋白質フォールディング / 水素/重水素交換 / 二次元NMR / 変性状態 / 残存構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高濃度変性剤中の球状蛋白質の残存構造の解析は，蛋白質のフォールディング研究にとって重要な問題である。本研究では，代表的な球状蛋白質を対象として，高濃度変性剤中におけるペプチドNH基の水素/重水素（H/D）交換反応を，スピン脱塩カラムと二次元NMR法を用いて解析し，変性蛋白質中の残存構造の詳細を明らかにする。2020年度は，ユビキチン（Ub）とプロテインAのBドメイン（BDPA）を対象とした。Ubは(α+β)型であるのに対し，BDPAは(All α)型であるので，構造クラスの異なる蛋白質について調べることが出来る。
実験では，6 M塩化グアニジニウム（GdmCl）中でH/D交換反応を実施した（pH* 3.3, 15℃）。異なる交換時間の蛋白質溶液を，スピン脱塩カラムを用いてH/D交換反応停止液（95%ジメチルスルホキシド-d6）に溶媒交換し，停止液中の蛋白質の二次元NMRスペクトルを測定する。各ペプチドNH基のクロスピーク強度の交換時間依存性から，各NH基のH/D交換保護因子（P）を求める。
Ubの72個あるNH基の内，60個のNH基のシグナルを二次元NMRスペクトル上に帰属し，これらのP値を求めた。その結果，6 M GdmCl中においても，蛋白質は完全なランダムコイルではなく，天然構造中でN末端側のβヘアピンと中間αヘリックスの部分に，水素交換保護されている残基が観測された。これらの残基のP値はP=2～4であり，これは水素結合形成の割合にして，0.5～0.75に相当する。したがって，6 M GdmCl中でも，Ubには天然様残存構造があり，これらが，フォールディング分子機構に関与していることが示唆される。BDPAについては，現在，二次元NMRスペクトル上のNH基シグナルの帰属を進めているが，こちらについても，同様の残存構造の存在を示唆する予備的結果が得られている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定した，Ub（ユビキチン）の残存構造解析を終えることが出来たので，おおむね順調に進展していると言える。しかし，COVID-19によるコロナ禍で緊急事態宣言のため，研究代表者が愛知県岡崎市の研究所を訪問することが困難となる時期もあった。その間，研究成果の論文作成に専念したが，BDPAの実験については予定より少し遅れることとなっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後，BDPAのGdmCl中でアンフォールディングした(U)状態の残存構造の解析を終了させる。また，UbともBDPAとも異なる構造クラスである，(All β)型蛋白質（例えば，βサンドイッチ型のフィブロネクチンIII型ドメイン）についても，同様の解析を進め，U状態における残存構造の存在が，構造クラスの異なる蛋白質にも見られる，一般的な現象であるかを明らかにしたい。
更に，本研究で観測された，NH基の残存構造がGdmCl濃度によってどのように変化するのかも明らかにしたい。そのため，安定性の低下したBDPA変異体を作成し，これらを用いて，スピン脱塩カラム利用-ジメチルスルホキシド停止-H/D交換-2D NMR法の実験を行い，U状態における残存構造のGdmCl濃度依存性を調べる。これにより，蛋白質の巻き戻り条件（天然条件）下における，U状態の残存構造を推定することができ，その成果は，蛋白質フォールディング研究の新たな局面をもたらすと期待される。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍のため，予定されていた，蛋白質科学会や生物物理学会の年会が，中止あるいはZOOMによるオンライン開催となった。そのため，予定して計上していた旅費が浮いてしまった。次年度以降の，物品費及び旅費として使用する予定である。
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