2022 Fiscal Year Research-status Report
Residual Structures of Denatured Proteins Studied by Two-Dimensional NMR Using a Spin-Desalting Column
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20K06574
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
桑島 邦博 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 名誉教授 (70091444)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 晃一 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 教授 (20211849)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 蛋白質フォールディング / 水素/重水素交換 / 二次元NMR / 変性状態 / 残存構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高濃度変性剤中の球状蛋白質の残存構造の解析は，蛋白質フォールディング研究にとって重要な問題である。本研究では，代表的な球状蛋白質を対象として，高濃度変性剤中におけるペプチド・アミド（NH）基の水素/重水素（H/D）交換反応を，スピン脱塩カラム利用ジメチルスルホキシド（DMSO）停止H/D交換二次元（2D）NMR法を用いて解析し，変性蛋白質中の残存構造を明らかにする。昨年度の研究で，プロテインAのBドメイン（BDPA）は，6 M塩化グアニジニウム（GdmCl）中で十分に広がったU状態においても，天然（N）状態でαヘリックスを形成している領域において，H/D交換保護因子（P）が2～5となる残存構造を有していることが明らかとなった。本年度はこの結果をさらに補強するため，N状態を不安定化したBDPA変異体L20A（残基20番目のLeuをAlaに置換した変異体）を作成し，その安定性を調査するとともに，L20A変異体のU状態におけるH/D交換反応に関する予備的実験を行った。以下の結果が得られた。
(1) L20A変異体のアンフォールディング転移：222 nmの円二色性スペクトルを用いて，L20A変異体のGdmClによるアンフォールディング転移を測定し野生型のものと比較した（重水90%, pD 3.8, 15℃）。L20A変異体では，転移の中点が野生型の3.5 Mから1.7 M GdmClまで低下し，GdmCl 3.0 M以上で十分U状態にあることが分かった。
(2) L20A変異体の2D NMRスペクトルとH/D交換反応測定：15N標識したL20A変異体を作成し，DMSO溶液中の1H-15N HSQCスペクトルを測定するとともに，3.0 M GdmCl中でU状態にあるL20A変異体のH/D交換反応を調べた。P値が6.0 M GdmCl中の野生型BDPAの値より10-50%程度大きくなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の遂行には，研究代表者の桑島が愛知県岡崎市の研究所を訪問し，共同実験を実施することが不可欠である。研究開始の令和２年度以来，COVID-19のコロナ禍のため，十分の共同実験ができない状況が続いた。そのため，本年度は，今までの成果を２報の論文にまとめることに集中し，共同実験としては，L20A変異体の作成とその安定性解析，H/D交換反応測定の予備的実験を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
L20A変異体を用いてU状態におけるH/D交換反応のGdmCl濃度依存性を調べる予定である。これにより，U状態のおける残存構造と蛋白質フォールディング機構との関係をより一層明確にすることができる。
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| Causes of Carryover |
本研究の完成度を高めるため，BDPAのL20A変異体のU状態における残存構造のGdmCl濃度依存性を調べることを計画している。この計画を実行するために次年度使用額を残すことが必要であった。
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