2020 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of driving forces underlying protein folding coupled with ligand binding.
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20K06578
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
槇 亙介 名古屋大学, 理学研究科, 准教授 (30361570)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / フォールディング / リガンド結合 / スタフィロコッカル・ヌクレアーぜ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、リガンド結合を伴うフォールディングについて、反応に関わる分子種や遷移状態の安定性と構造に基づいて、反応を駆動する物理的相互作用を明らかにすることを目的とする。目的の達成のため、モデル蛋白質スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase)を用いた。SNaseの特異的リガンドである基質アナログadenosine-3',5'-diphosphate (prAp)によるフォールディングを蛍光、円二色性(CD)を用いて系統的に観測した。また、共同研究を通じて、核磁気共鳴法(NMR)を用いた残基レベルの観測および分子動力学シミュレーション(MD)を用いた原子レベルでの解析をも行った。得られた結果に基づき、反応機構を、イジング様モデルを用いて解析することによって、反応の物理的駆動力を調べた。
尿素2.9 M存在下の穏和な変性条件下において、prAp添加によってSNaseのリガンド誘導フォールディングを実現した。反応のprAp濃度依存性を測定することにより、その主要な反応経路がprAp濃度依存的にConformational selection(CS:構造形成→リガンド結合)からInduced fit(IF:リガンド結合→構造形成)へとシフトすることを見出した。特に、NMRおよびMDによる結果から、IF条件下において、SNaseとprApとが天然/非天然様相互作用を通じて緩やかに結合していることがわかった。さらにモデルを用いた解析により、リガンド濃度依存的に反応の自由エネルギー・ランドスケープがCSからIFへと移り変わることを明らかにした。反応の遷移状態が、prApのもつ二つのリン酸基に由来すると考えられる静電相互作用によって安定化されることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和二年度に計画していた研究項目である野生型SNaseのリガンドによるフォールディング条件の最適化、CDおよび蛍光を用いたフォールディング速度論・平衡論の測定、測定結果に基づいた統計力学モデルを用いた解析、同位体ラベル野生型SNaseの調製およびその天然状態のNMRスペクトルの帰属は終了した。さらに令和三年度に計画していた研究項目のうち、NMRを用いた実時間フォールディング測定およびその残基レベルの解析、変性状態のNMRスペクトルの帰属および変性状態におけるリガンド・蛋白質複合体の残基レベルの解析が終了した。現在、prApからリン酸基を一つずつ除去したprAおよびrApを用いたフォールディングを調べており、予備的な結果が得られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和二年度において実施した研究によって、リガンドによるSNaseのフォールディング、特にその遷移状態の形成において静電相互作用が果たす役割が大きいことが示唆された。静電相互作用は、prApがもつ二つのリン酸基に由来することが予想されるので、これらのリン酸基それぞれがSNaseのフォールディングに果たす役割を明らかにすることが重要であるとの認識に至った。このため、prApのリン酸基をそれぞれ一つずつ除去した「変異体リガンド」を用いて、SNaseのフォールディングに対するそれぞれのリン酸基の寄与を原子団レベルで明らかにすることを優先課題とする。
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| Causes of Carryover |
令和二年度は、設備備品として日本分光株式会社製分光蛍光光度計(FP-8300)を購入し、その他の物品を購入した。新型コロナ感染症の拡大に伴い、参加予定学会がオンライン開催になり、旅費の支出がなくなった一方、論文掲載費による支出が予想より多かった。「次年度使用額」は令和三年度における研究推進のための主として物品費として使用する計画である。
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