2022 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation of driving forces underlying protein folding coupled with ligand binding.

Research Project

Project/Area Number	20K06578
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	槇亙介名古屋大学, 理学研究科, 准教授 (30361570)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	蛋白質 / フォールディング / リガンド結合 / スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、リガンド結合を伴うフォールディングについて、反応に関わる分子種や遷移状態の安定性と構造に基づいて、反応を駆動する物理的相互作用を明らかにすることを目的とする。目的の達成のため、モデル蛋白質スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase)を用いて、SNaseの特異的リガンドである基質アナログadenosine-3',5'-diphosphate (prAp)によって引き起こされるフォールディングを実験とモデル解析によって調べる。令和2-3年度には、1. フォールディングの経路が、prAp濃度依存的にConformational selection (CS: 構造形成→リガンド結合)からInduced fit (IF: リガンド結合→構造形成)に切り替わり、反応の遷移状態がprApの二つのリン酸基に由来する静電相互作用によって安定化されることが示唆され、2. prApから一つリン酸基を欠損した「prAp変異体」adenosine-5'-monophosphate (prA: prApから3'-リン酸基を欠損)とadenosine-3'-monophosphate (rAp: prApから5'-リン酸基を欠損)を用いた解析により、IFが支配的な高リガンド濃度において、ほどけた状態は5'-リン酸基とより親和性が高いが、遷移状態は3'-リン酸基が安定化により寄与することが示唆された。令和4年度は、令和3年度から引き続きprApとその「変異体」prAおよびrApを用いたNMRおよび蛍光を用いた速度論測定と解析を行った。測定については特に再現性を確認し、解析については結果の定量的な妥当性を検討した。得られた結果の一部を論文としてまとめた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和4年度に計画していた研究項目のうち一部を令和3年度に着手していたことを受け、令和4年度は令和3年度から引き続き、prApおよびprApからリン酸基を一つずつ除去したprAおよびrApを用いたフォールディングを調べた。令和3年度の時点では、実験において結果の再現性にやや不確かさが認められた。具体的にはリガンド結合を伴うフォールディング反応速度論に関して、その反応速度を精査する必要が認められた。反応速度定数を評価する上で、シグナルである蛍光強度変化がフィッティングするにはやや小さく、また緩和が遅かった(約1000秒)。結果として、反応のリガンド濃度依存性も小さかった。反応速度定数のリガンド濃度依存性は本研究を進める上で鍵になる部分のひとつであり、リガンドと蛋白質との間の親和性（解離定数）、さらには対応する自由エネルギーを評価するための指標であることから、再現性を十分に担保する必要があった。このため、すべてのリガンドに関わる測定に関して、再現性を確認した。解析に際しては最小二乗法に加えてT検定を用いて得られた結果の妥当性を評価した。
Strategy for Future Research Activity	令和3年度に得られた成果に基づき、令和4年度においてはこれまでの結果を精査し、得られた成果の一部を学会で発表し、論文にまとめた。これまでに得られた成果によって、SNaseのリガンド結合によるフォールディングについて、特にIF条件下におけるリガンドのそれぞれのリン酸基の役割が明らかになった。一方、まだ明らかになっていない点がある。具体的には1. CS条件下でのフォールディング機構、2. CS、IF、自発的フォールディング間での反応駆動力の類似点と相違点についてである。リガンド濃度や変性剤濃度、さらには温度などの溶媒条件を制御することにより、これらのフォールディングを選択的に引き起こすことができるので、これまで以上に広範な条件下においてフォールディング反応を観測することにより、上記の問題の解決を見ることができると考えられる。このような観点から、令和5年度は、IF条件以外でのリガンド結合によるフォールディングの詳細をさらに調べ、リガンド結合を伴う蛋白質のフォールディングについて統一的な物理化学的理解を得る。
Causes of Carryover	令和4年度は、消耗品等の物品を購入した。新型コロナ感染症の拡大に伴い、旅費の支出がなくなった。そのため「次年度使用額」が生じた。「次年度使用額」は令和5年度における研究推進のための主として物品費として使用する計画である。