2020 Fiscal Year Research-status Report
超解像・１分子イメージングによる転写ハブを介したクロマチンネットワークの動態解析
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20K06594
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
日比野 佳代 国立遺伝学研究所, 遺伝メカニズム研究系, 助教 (40435673)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ゲノムDNA / RNA転写 / 1分子イメージング / ヌクレオソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、細胞内1分子イメージングにより、転写阻害剤処理がゲノムクロマチンの動きを核全体においてグローバルに上昇させることを見出してきた（Nozaki, 2017; Nagashima, 2019）。この結果をもとに、作業仮説：「巨大な転写装置クラスターをハブとしたグローバルなクロマチンネットワークが存在し、これを介してクロマチン動態と転写が密接に制御されている」（Nagashima, 2019）を立てた。本研究では、超解像顕微鏡技術、単一ヌクレオソームイメージング、計算機シミュレーションを組み合わせ、（1）転写クラスターの動態とそのクロマチン構造や動態への影響、（2）転写クラスターとクロマチンの連結機構、（3）クロマチンネットワークの実態を調べ、仮説を検証する。これにより、生きた細胞でのクロマチン動態と転写制御の関係を明らかにし、遺伝子発現制御機構に迫ることを目的とする。
今年度は（1）転写クラスターの動態とそのクロマチン構造や動態への影響の解析に取り組んだ。転写クラスターの構成因子であるヒトの転写メディエーターのサブユニットMED14に緑色蛍光タンパク質mCloverを融合させ、これを恒常的に発現する細胞株を樹立した。この細胞株中のMED14クラスターの数、大きさ、空間分布やその時間変化を解析し、転写クラスターの動態の基本情報を得た。MED14は相分離駆動の液滴を形成することが報告されている。そこで液滴を溶かす作用を持つ1,6-ヘキサンジオール（1,6-HD）により転写クラスターを分散させ、クロマチンの動きを調べた。その結果、MED14クラスターは消失したが、クロマチンの動きは抑制された。これは予想に反する結果であったが、相分離生物学分野で多用されている1,6-HDが細胞内のDNAを凝集させる作用を持つことを示す成果となった(Itoh, 2021)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要で示した予想外の作用や、新型コロナ感染症拡大防止に伴う研究活動や企業活動の制約による資材の入手難など、当初の予定とは異なる点があったが、研究はおおむね順調に進展している。予想外の作用の発見は、相分離生物学分野で多用されている薬剤1,6-HDがゲノムDNAへどのような影響を与えるかを示す報告となり、当該分野に注意喚起を促す成果となった。また、資材入手難による物品調達の遅延は、代替物品の利用により影響を少なくするとともに、遅延自体も今年度中におおむね解消する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR/Cas9ゲノム編集を用いて、上述のMED14-mCloverにAuxin inducible degron (AID)法により転写クラスターを短時間分解除去するためのmAIDタグを融合させる（MED14-mAID-mClover）。AID法は、特定のタンパク質を短時間で分解除去し、そのタンパク質の役割を解析する方法である（Natsume, 2016）。MED14-mAID-mCloverに加え、Auxinの添加によるタンパク質の分解を担うOsTIR1、単一ヌクレオソームイメージングのためのヒストンH2B-Halo、以上3者を発現するヒトHCT116細胞株を樹立する。クロマチン構造解析のための超解像イメージングには、Haloを介した蛍光ラベルのかわりにphotoactivatable蛍光タンパク質を用いる。樹立した細胞株にAuxinを添加し、MED14の短時間除去を行う。除去前後で、単一ヌクレオソームイメージングおよびクロマチンの超解像イメージングを行い、転写クラスターの破壊がクロマチン動態や構造に与える影響を調べる。さらに、転写クラスターの構成因子であるcoactivator（BRD4など）や転写反応を担うRNAPIIをその阻害剤JQ1やa-amanitinで転写装置から解離させ、その後、クロマチンの動態や構造を計測する。また、同時に転写クラスターの動態も計測する。仮説が正しければ、転写装置ハブ形成を阻害するこれらの細胞操作により、MED14クラスターが消失し、その結果クロマチン動態が上昇し、クロマチンドメイン間のコンタクト構造なども変化するはずである。これらの解析を通して、目的（1）転写クラスターの動態とそのクロマチン構造や動態への影響を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの影響による資材の入手難により、次年度使用額が生じた。資材入手難による物品調達の遅延は、2021年度中におおむね解消する予定である。
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