2020 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集を利用した非コードDNAによるインスレーター機能の解析
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20K06602
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
坂本 尚昭 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 准教授 (00332338)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
粟津 暁紀 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 准教授 (00448234)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / インスレーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、近年急速に発展したゲノム編集技術を利用し、インスレーター結合タンパク質に依存しない新しいタイプのインスレーターの物理的特性と作用機構およびゲノム機能発現と核内構造における役割を明らかにすることを目的とする。
バフンウニの内在のArsインスレーターへの変異導入を目的とし、より広範囲の欠失変異導入が可能なCRISPR-Cas3システムのウニへの適用を試みた。システムを構成する各因子（Cse1, Cse2, Cas3, Cas5, Cas6, Cas7）が連結したCascaseのmRNA、もしくは別々のmRNAを作製してウニ胚に導入したが、どちらにおいても現時点では成功には至っていない。
CRISPR-Cas9システムを介したノックイン法の確立では、Pks1遺伝子を標的としたドナーベクターの作製を行い、750 bpのホモロジーアームをもつHDR修復用ベクターに加え、40 bp程度の短いホモロジーアームを用いるMMEJ修復用のベクターも完成した。また、相同組換えによるノックイン効率を上昇させるために、ドミナントネガティブ型DNA Ligase IV発現ベクターの作製も終了した。現在、PCRによりノックインが検出できているが、高率上昇を目指して条件を調整中である。
Arsインスレーター（578 bp）の物理的特性とインスレーター活性の相関を調べるために、比較対象となる５つのラムダDNA（578 bp）を用意した。現在のところ、これらの配列はポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示し、エンハンサーに対する効果も異なることが明らかとなった。また、Arsインスレーターの物理的特性の解析では、in vitro再構成系においてArsインスレーターが非常に不安定なヌクレオソームを形成できることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
解析の対象配列については、トリプレットリピート配列は揃い、他のリピート配列についても進めつつある。また、新たに５種類のラムダDNA配列も対象に加え、次の解析に進みつつある。
ゲノム編集実験に関しては、必要なツールの準備は順調に進んでいる。CRISPR-Cas3システムについては、まだ成功に至ってないが、実験条件のチューニングが必要であると考える。ノックインについても、ドナーベクターやNHEJ阻害ツール（薬剤およびドミナントネガティブ型DNA Ligase IV）も揃い、次のステップでの条件設定の最中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、解析の対象配列はさらに、ジヌクレオチドリピートやヌクレオソームを排除する性質をもつNENLIS配列について、増やしていく予定である。
ゲノム編集に関しては、CRISPR-Cas3の条件設定を行い利用可能にしていく。もしCRISPR-Cas3が利用不可能であった場合には、CRISPR-Cas9によるノックインを介した変異導入を中心に手法を確立していく方針である。CRISPR-Cas9によるノックインに関しては、より効果の高いノックイン法を確立し、ゲノム中の内在のArsインスレーターへの変異導入へと移る予定である。
レポーターを用いたDNA物理的特性とインスレーター活性の相関の解析については、揃った対象配列について順次解析を行う。とくに、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の移動度によるDNA柔軟性の解析、Atomic Force Microscopy (AFM) による持続長の解析については、早急に行う予定である。
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[Presentation] MaChIAto: detailed profiling tool for various genomic features affecting the efficacy of gene knockout, homology-based knock-in, and Prime Editing2020
Author(s)
Sakura T, Nakamae K, Takenaga M, Nakade S, Mitsuhashi T, Nazuka I, Awazu A, Sakamoto N, Yamamoto T
Organizer
CRISPR and Beyond
Int'l Joint Research
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