2020 Fiscal Year Research-status Report

Meiotic G2/M-phase transition by maturation-inducing hormonal signaling

Research Project

Project/Area Number	20K06618
Research Institution	Ochanomizu University
Principal Investigator	岸本健雄お茶の水女子大学, サイエンス&エデュケーションセンター, 客員教授 (00124222)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	奥村英一東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (00323808)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	細胞周期制御 / 卵細胞 / 細胞内情報伝達 / 卵成熟誘起ホルモン受容体 / cyclin B-Cdk1
Outline of Annual Research Achievements	本計画では、ヒトデの卵成熟誘起ホルモンである1-methyladenine (1-MeAde) の卵表受容体の分子実体を同定し、卵成熟誘起ホルモンによるG2/M期移行シグナリングの全容を全動物で最初に判明させることを目指している。事前研究から、この卵表受容体と期待されるGPCR (G protein-coupled receptor) のcDNAを一つに絞ることができているので、まずは、このcDNAがコードするタンパク質（候補GPCR）がまさに目指している分子であることを確証したい。そのために、本年度は以下の(1)、(2)の実験を実施した。 (1) 候補GPCRのC末ペプチドを抗原とする抗体（C末抗体）を作成し、抗原タンパクは卵表層に局在することを蛍光抗体法で確認した。この結果は、候補GPCRが目的の受容体である可能性を支持している。 (2) GPCRのC末テイル部はGPCRとGbgとの結合に関わることが知られているので、上記(1)のC末抗体はGPCR活性の阻害抗体（中和抗体）として機能し、1-MeAdeによる卵成熟開始を抑えることが期待される。そこで、このC末抗体を未成熟卵内に微小注射して1-MeAde処理したが、期待した効果は得られなかった。 (3) 上記(2)が不首尾に終わった理由として、微小注射したC末抗体が卵表層に集積しなかった可能性が考えられる。そこで、抗体を表層にターゲティングする道具として、組換えタンパク（SrcのN末14アミノ酸配列-Protein A由来のZZドメイン-HisX6）を作製した。それが期待通りに抗体を卵表層に集積させる機能を発揮するかどうかを、目下、蛍光ラベルしたIgGを用いて検証しているところである。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 最大の理由としては、コロナ禍による緊急事態宣言で、実験を思い通りに進められなかったことが挙げられる。具体的には、単純に、実験の実施そのものに時間的な制約があったことだけではない。実験材料であるヒトデは採集後に実験室内で維持しており、通常時でも卵を実験に使用できる時期は限られるが、その限られた期間に合致するように実験を実施できなかったことが少なからず影響した。コロナ禍の速やかな収束を待つしかない。
Strategy for Future Research Activity	今年度に試みた「候補GPCRの機能阻害による必要性の証明」こそが、本研究計画での最重要課題である。そのため、上述した「抗体の表層ターゲティング法」の開発と「中和抗体」の作製には、あらゆる手を尽くしたい。具体的には、「抗体の表層ターゲティング法」については、現在使用中の“SrcのN末14アミノ酸配列”が不首尾の場合は、myristoyl化だけでなくpalmitoyl化との両方の脂質修飾を受ける配列；しかもSrc由来だけでなく、他の表層局在タンパク由来のものも考慮中である。一方、「中和抗体」については、現在使用中のC末抗体だけでなく、GPCRの３番目の細胞内ループ抗体（ICL3抗体；Gaとの結合阻害を期待）や、GPCRの２番目の細胞外ループ抗体（ECL2抗体）を既に作製済みである。さらに、他の配列部位に対する抗体の作製、あるいは全く別個に、Trim-Awayなどによるタンパク分解法で候補GPCRを特異的に分解することも考慮中である。
Causes of Carryover	「進捗状況」の項でも述べた通り、コロナ禍で思い通りに実験を実施できなかったのが主たる理由である。他にも、出席予定の学会がオンライン開催に変更されたりキャンセルされたため、出張旅費が不要になったことも理由である。生じた次年度使用分は、今後、実験の遅れを取り戻す過程で、物品費や人件費に使用する予定である。
Remarks	（一般社団法人）国立沖縄自然史博物館設立準備委員会機関誌「ナチュラルヒストリーミュージアム」No.1の創刊・編集（Print edition ISSN 2436-0198; Online edition ISSN 2436-0406）