2020 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of signal transduction and cell growth by protein phosphatase 2A
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20K06619
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
桜井 博 金沢大学, 保健学系, 教授 (00225848)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荒磯 裕平 金沢大学, 保健学系, 助教 (20753726)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Rbがん抑制遺伝子 / E2F転写調節因子 / IER2タンパク / Protein phosphatase 2A / 細胞周期 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質のリン酸化は主要なシグナル伝達ツールであり、リン酸化の有無によりシグナル伝達タンパクや代謝調節タンパクや転写調節因子の機能が正または負に制御される。細胞周期の進行を制御するCyclin-CDK (Cyclin-dependent kinase)やRbがん抑制タンパク-E2F転写調節因子の活性もリン酸化/脱リン酸化により制御されている。一方、プロテインホスファターゼPP2Aは、さまざまな機能に関与する300種以上のリン酸化タンパク質の脱リン酸化を触媒する。PP2Aのアダプタータンパクは、PP2Aと標的リン酸化タンパクの両方に結合し、PP2Aによる脱リン酸化を制御する。
令和２年度は、PP2AのアダプタータンパクであるIER2（immediate early response 2）の機能について注目した。IERファミリー (IER2, IER5, IER5L) はN末端約50アミノ酸に高い相同性を持ち、この領域でPP2AのB調節サブユニットに結合する。さらに、CDC25AなどのPP2A標的タンパクに結合し、PP2Aによる脱リン酸化を促進する。IER2ノックダウンおよび過剰発現細胞、Reverse-transcription quantitative PCR（RT-qPCR）法、western blot法、共免疫沈降やin vitro結合実験、in vitro脱リン酸化実験、クロマチン免疫沈降法を用いて、IER2-PP2AによるRb-E2Fの活性調節について解析した。その結果、IER2はPP2AによるRbの脱リン酸化を促進し、これによりE2F1転写調節因子の活性が抑制され、細胞周期の進行を調節するCyclin D1やp21の発現が抑制された。これらの結果は、プロテインホスファターゼが細胞周期の調節に深く関与することを示した重要な研究結果である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、「さまざまなアダプタータンパクによりPP2A活性がどのように調節され、それによりリン酸化カスケードによるシグナル伝達がどのように調節されるか」について解析することにより、最終的に「細胞増殖や腫瘍形成がどのように制御されるか」について考察する。
令和２年度は、アダプタータンパクIER2とIER5がどのようにPP2Aに結合するかについて検討を行い、両タンパクの相同領域にPP2Aとの結合を阻害するアミノ酸置換変異を同定した。また、共免疫沈降およびin vitro結合実験より、IER2が直接Rbに結合することを明らかにした。In vitroホスファターゼ実験によりIER2がPP2AによるRbの脱リン酸化を促進することを示した。IER2のノックダウンまたは過剰発現細胞を用いて解析を行い、IER2はRbの脱リン酸化を促進することを示した。さらに、脱リン酸化型Rbが転写調節因子E2F1の活性を阻害し、その標的遺伝子であるCyclin D1やp21の発現が抑制された。これらの結果より、IER2-PP2A→Rb-E2F1→Cyclin D1・p21というカスケードが示され、研究目的である「アダプタータンパクによりPP2A活性がどのように調節され、それによりリン酸化カスケードによるシグナル伝達がどのように調節されるか」の一端が明らかになった。さらに、IER2のノックダウンまたは過剰発現により細胞周期がどのように調節されるかについてフローサイトメトリーにより解析し、誌上発表する予定である。
このように、本研究テーマは、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
PP2AのアダプタータンパクとしてIER2以外にも、IER5、SERTAD1 (SERTA domain 1)、CDCA4 (Cell division cycle associated 4)などを同定している。これらのアダプタータンパクもIER2と同様にRbファミリータンパク（Rb、p107、p130）の脱リン酸化に関与するかについて検討する。具体的には、おのおののノックダウンおよび過剰発現細胞を作製し、抗リン酸化抗体を用いたwestern blot法によるRbファミリータンパクのリン酸化状態の検討、クロマチン免疫沈降によるRb-E2FのDNA結合能力の変動、RT-qPCR法による細胞周期関連遺伝子の発現調節を解析する。さらに、おのおののアダプターによる細胞周期の制御は、ノックダウンや過剰発現細胞のフローサイトメトリー解析により明らかにする。これらの研究結果により、異なるアダプタータンパクによりRbファミリータンパクのリン酸化およびE2Fの転写活性化能力がどのように制御され、細胞周期関連遺伝子の発現がどのように変動し、細胞周期がどのように調節されるかについて検討する。
一方、これらのアダプタータンパクは相同領域を介してPP2AのB調節サブユニットに結合する。この相同領域単独、さらにはPP2Aとアダプター複合体の立体構造を明らかにする。まずは大腸菌発現系を用いてアダプター相同領域の大量精製系を構築し、X線結晶構造解析によって立体構造を得る。さらに、既に結晶構造の報告されているPP2A (PBD ID: 3DW8) の構造情報から、PP2Aがアダプターを選択的に認識し、基質タンパク質を脱リン酸化活性中心へリクルートする機構を考察する。
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| Causes of Carryover |
予定していた物品が令和２年度中に納品できないとの連絡が納入業者からあり、次年度に購入することに変更したため次年度使用額が生じた。次年度使用額と令和３年度に請求した助成金については、抗体やPCR関連試薬等の購入に充てる予定である。
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Research Products
(2 results)
