2020 Fiscal Year Research-status Report

Functional Analyses of the Novel Ciliary-Dynein Pre-assembly Complex

Research Project

Project/Area Number	20K06622
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	山本遼介大阪大学, 理学研究科, 助教 (10743114)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	繊毛 / ダイニン / クラミドモナス / 前集合 / pre-assembly / Crisper / 変異株 / 運動性
Outline of Annual Research Achievements	本年度は繊毛ダイニンの細胞質内における組み立て/折り畳み(前集合)に関与する可能性が示唆された新規繊毛ダイニン前集合因子候補(PAF:Pre-Assembly Factor candidate)のクラミドモナス変異株の表現型解析を主として行った。我々の研究室で同定された2種のクラミドモナスPAFタンパク質(PAFA/PAFB)はパラログ同士であり、一次配列上は非常に高い相同性を持っていた。共同研究により、Crisper/Cas9法を用いてクラミドモナスのPAFA/PAFB変異株を作成した。PAFA/PAFB変異株の運動性解析を行ったところ、両変異株とも運動性異常を示し、繊毛波形も異常になっている可能性が示唆された。また、興味深いことに、これらの変異株の運動性は液体培養日数が増えるに従い、顕著に低下していく可能性も明らかとなった。この現象は既知のクラミドモナス繊毛ダイニン前集合異常株とも共通する特徴であり、PAFタンパク質が実際に繊毛ダイニンの前集合機構に関与している可能性を示唆している。Crisper/Cas9法よりPAFA/PAFB遺伝子を両方欠損する2重変異株の作成にも成功した。今後は、実際にPAF変異株の繊毛ダイニン量を野生型と詳細に比較すると同時に、変異株の運動性が経時的に変化する分子機構についても詳細に解析していく予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 我々の研究室で同定した繊毛ダイニン前集合への関与が示唆される2種の分子(PAFA/PAFB)について、単細胞緑藻クラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)をモデル生物として用い、共同研究よりこれらの変異株を作成することが出来た。表現型解析より、両変異株において運動性/繊毛波形共に野生型とは顕著に異なる興味深い表現型を得ている。また、液体培地内での培養期間に応じて運動性が顕著に低下するという興味深い表現型も観察された。ただし、新型コロナウイルス感染症の影響で研究期間が全学的に通常とは大きく異なっていたため、本研究の進行が若干阻害された点は否定できない。次年度以降は、PAF変異株の表現型を引き起こす分子基盤に迫っていきたいと考えている。
Strategy for Future Research Activity	次年度以降は、PAFA/PAFBに対する抗体を作成し、Crisper/Cas9法により作成した各々の変異株についてそれぞれで細胞内のPAFA/PAFBタンパク質がどのような状態で存在しているのかを確認する。また、PAFA/PAFB変異株の繊毛内のダイニン量についても、質量分析法など感度の高い手法により野生型と比較して何かしらの異常が存在するかを詳細に決定する予定である。同時に、「既知のクラミドモナス前集合変異株であるmot48-2/pf23株等の原因遺伝子産物とPAFA/PAFBタンパク質が細胞体内で相互作用するのか」「繊毛ダイニン前集合機構でPAFA/PAFBが他の前集合因子とどのような関連があるのか」等を生化学的/遺伝学的な手法により決定していきたいと考えている。
Causes of Carryover	本年度は、PAFA/PAFB変異株のレスキュー株、及びPAFA/PAFBタンパク質の抗体を作成する予定であったが、当該変異株が予想外に興味深い表現型を示したために、年度中は表現型解析に注力し、これらの生化学/分子生物学実験に纏わる経費の使用が次年度以降に持ち越された。また新型コロナウイルス感染症の影響により、全学において研究期間が不規則となった事実も次年度使用額が生じた一因となっており、次年度以降、PAFA/PAFBの抗体作成や分子タグが付与されたPAFA/PAFB変異株のレスキュー株作成等に当該研究費を使用予定である。