2020 Fiscal Year Research-status Report
The role of two TOR complexes in adaptation of eukaryotic cells to the low-glucose environment
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20K06630
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
豊田 雄介 久留米大学, 分子生命科学研究所, 助教 (10587653)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 低濃度グルコース / 分裂酵母 / 糖輸送体 / ユビキチン化 / TORC2経路 / アレスチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核細胞の栄養環境の変化に対する応答においてTORC1、TORC2シグナル伝達経路は重要な役割を果たす。分裂酵母細胞が低濃度グルコース環境で増殖するためには六炭糖輸送体Ght5とTORC2経路が必要であることを我々は示してきた。TORC2経路はGht5の細胞表面局在に必要である一方、背景にある分子機構が不明であった。そこで、低濃度グルコース環境で増殖し、なおかつGht5の表面局在を回復したTORC2経路欠損変異細胞が持つ変異遺伝子をスクリーニングしたところ、E3ユビキチンリガーゼを細胞膜タンパク質にリクルートする機能未解析のαアレスチンSPCC584.15c(Aly3と命名)やTORC1活性を抑制するタンパク質群をコードする遺伝子に変異が見出された。中でもaly3+を変異または欠失したTORC2経路欠損変異細胞ではGht5の表面局在が完全に回復していた。そして、aly3+に類似する分裂酵母αアレスチン様遺伝子(aly1+, aly2+, rod1+)の欠失は、TORC2経路欠損変異細胞が示すGht5の局在異常や低濃度グルコース環境での増殖欠損のいずれも回復しなかった。このため、本研究では、Ght5の細胞表面局在制御におけるAly3とTORC2経路の関係に着目した。アレスチンは一般に、E3ユビキチンリガーゼによる細胞膜タンパク質のユビキチン化を促進し、ユビキチン化膜タンパク質の液胞への選択輸送を促進すると考えられている。そこで、抗ユビキチン抗体を用いてユビキチン化Ght5を検出した結果、野生型細胞と比較して、TORC2経路欠損変異細胞ではユビキチン化Ght5が増量していた。この増量はAly3に依存していたことから、TORC2経路はAly3を介したGht5のユビキチン化を阻害することによってGht5の表面局在を保障していることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、TORC2経路が糖輸送体Ght5の細胞表面局在を保障する分子機構の解明である。より具体的には、Ght5が細胞表面から液胞へ輸送されるまでの過程の中で、TORC2経路が制御する過程を明らかにすることである。現在までの結果から、細胞表面にあるGht5がユビキチン化修飾を受ける過程をTORC2経路が阻害することが明らかとなった。この結果は、本研究の目的の達成の主要部分を構成するものと考えられる。本研究の主要な問いへの答えを得つつある状況なので、本研究は順調に進展していると考えられる。TORC2経路は、Ght5のユビキチン化という液胞への選択輸送の最上流を制御する一方で、TORC1が作用する過程は未だに不明であるため、この点は今後への課題である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、細胞表面に局在するGht5の液胞への輸送の最上流の過程であるAly3依存的なユビキチン化をTORC2経路が阻害する、という知見をこれまでに得た。今後は、TORC2キナーゼ複合体とその下流で機能するAkt様キナーゼGad8がAly3をリン酸化することによってAly3とE3ユビキチンリガーゼとの相互作用を制御する可能性を追求する。Aly3のSer460はAkt/Gad8キナーゼのコンセンサス配列に合致し、実際にリン酸化を受けていることがプロテオミクス研究により報告されている。今後の研究の目的のためには、アフィニティー精製したAly3と相互作用するタンパク質の同定や、リン酸化Aly3の検出が重要である。Aly3はN末端あるいはC末端にエピトープタグを付加すると遺伝子機能が失われることが前年度の解析で判明したため、Aly3に対する抗体が必要である。このような抗Aly3抗体とリン酸化抗体を昨年度に作製したため、今後はこれらの抗体を活用して研究を推進する。
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| Causes of Carryover |
前年度に計画した実験が効率的に実施できたことと、コロナウイルス感染拡大抑制のため労働時間を一部削減する必要があったため、次年度使用額が生じました。当該助成金は、前年度に得られた研究成果を発展させるために必要な実験を今後実施していくために、使用します。具体的には、質量分析による相互作用タンパク質の解析の委託や、必要な抗体、試薬類、消耗品の購入に主に使用する計画です。
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