2020 Fiscal Year Research-status Report
CRISPRゲノムワイドスクリーニングによるマクロピノサイトーシス制御因子の同定
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20K06636
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
坂巻 純一 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任助教 (10825938)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | マクロピノサイトーシス / CRISPR-Cas9システム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マクロピノサイトーシスは細胞膜のラメリポディアの伸長と退縮により、細胞外液とそこに含まれる高分子を細胞内に取り込み、リソソームで分解する機構である。
この機構はがん細胞で活性化しており、その生存と増殖のためのエネルギー供給源となっていることが示唆されている。しかし、この経路の分子制御機構は未だ不明な点が多く、特異的な阻害法が確立していない。本研究では、マクロピノサイトーシス制御遺伝子を網羅的に同定するために、CRISPR-Cas9システムを用いたゲノムワイドスクリーニングを行っている。スクリーニングで使用する活性型変異体KRas G12Vを有し、Cas9を発現するHEK293T細胞を作製し、19,050遺伝子を標的としたsgRNAライブラリーを導入した。作製した細胞を用いて、フローサイトメトリーによるマクロピノサイトーシス測定の最適化を行った。スクリーニングに着手し、作製した細胞にマクロピノサイトーシスプローブであるDQ-BSAを加え、プローブの蛍光強度が低い細胞集団を分取した。最初のスクリーニングでは、下位約１％の細胞集団をクロピノサイトーシス不全細胞集団として分取した。分取した細胞を増幅させ、同様の操作を繰り返し、マクロピノサイトーシス不全細胞の濃縮を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在、セルソーターを用いて、マクロピノサイトーシス不全細胞の濃縮を試みているが、期待されていた不全細胞集団はまだ得られていない。濃縮の操作をさらに繰り返す。また、マクロピノサイトーシス不全細胞の取り逃がしをなくすため、分取する細胞集団を増やすなどの試みを行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の方策によりマクロピノサイトーシス不全細胞集団を得る。この細胞集団を次世代シークエンスで分析し、どの遺伝子に対するsgRNAが多く見られるか解析することにより、マクロピノサイトーシスに必須な遺伝子を同定する。さらに、偽陽性の可能性を排除するため、再現実験を行う。同定した因子の細胞内局在や動態を調べる。
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| Causes of Carryover |
当該年度の直接経費はほぼ執行されており、1,200,000円のうち1,196,701円が使用された。次年度使用額は使用しきれなかった3,299円で、少額である。次年度に細胞培養用消耗品で使用する。
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Research Products
(2 results)
