2020 Fiscal Year Research-status Report

CRISPRゲノムワイドスクリーニングによるマクロピノサイトーシス制御因子の同定

Research Project

Project/Area Number	20K06636
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	坂巻純一東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任助教 (10825938)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	マクロピノサイトーシス / CRISPR-Cas9システム
Outline of Annual Research Achievements	マクロピノサイトーシスは細胞膜のラメリポディアの伸長と退縮により、細胞外液とそこに含まれる高分子を細胞内に取り込み、リソソームで分解する機構である。この機構はがん細胞で活性化しており、その生存と増殖のためのエネルギー供給源となっていることが示唆されている。しかし、この経路の分子制御機構は未だ不明な点が多く、特異的な阻害法が確立していない。本研究では、マクロピノサイトーシス制御遺伝子を網羅的に同定するために、CRISPR-Cas9システムを用いたゲノムワイドスクリーニングを行っている。スクリーニングで使用する活性型変異体KRas G12Vを有し、Cas9を発現するHEK293T細胞を作製し、19,050遺伝子を標的としたsgRNAライブラリーを導入した。作製した細胞を用いて、フローサイトメトリーによるマクロピノサイトーシス測定の最適化を行った。スクリーニングに着手し、作製した細胞にマクロピノサイトーシスプローブであるDQ-BSAを加え、プローブの蛍光強度が低い細胞集団を分取した。最初のスクリーニングでは、下位約１％の細胞集団をクロピノサイトーシス不全細胞集団として分取した。分取した細胞を増幅させ、同様の操作を繰り返し、マクロピノサイトーシス不全細胞の濃縮を試みた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 現在、セルソーターを用いて、マクロピノサイトーシス不全細胞の濃縮を試みているが、期待されていた不全細胞集団はまだ得られていない。濃縮の操作をさらに繰り返す。また、マクロピノサイトーシス不全細胞の取り逃がしをなくすため、分取する細胞集団を増やすなどの試みを行う。
Strategy for Future Research Activity	上記の方策によりマクロピノサイトーシス不全細胞集団を得る。この細胞集団を次世代シークエンスで分析し、どの遺伝子に対するsgRNAが多く見られるか解析することにより、マクロピノサイトーシスに必須な遺伝子を同定する。さらに、偽陽性の可能性を排除するため、再現実験を行う。同定した因子の細胞内局在や動態を調べる。
Causes of Carryover	当該年度の直接経費はほぼ執行されており、1,200,000円のうち1,196,701円が使用された。次年度使用額は使用しきれなかった3,299円で、少額である。次年度に細胞培養用消耗品で使用する。