外的環境と内的リソース蓄積をモニターするテトラピロールシグナル伝達系の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06638
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 小林 勇気 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (80644616)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: オルガネラ / 細胞周期 / 環境応答

Outline of Annual Research Achievements

単細胞藻類や高等植物の幹細胞では、オルガネラと核の分裂に至るプロセスには協調関係が見られる。申請者は、核のDNA複製はオルガネラDNA複製によって制御されており、葉緑体で合成されるテトラピロール分子の一種が、シグナルとして働いていることを明らかにした。また、オルガネラDNA複製の開始にもテトラピロールシグナルが関与することが判明している。申請者のこれまでの研究からオルガネラDNA複製を制御するテトラピロールシグナルの上流には光合成、呼吸、細胞内リソースの蓄積をモニターするチェックポイントが存在することが示唆された。そこで本研究では、オルガネラDNA複製のチェックポイントの分子機構を明らかにすることを目的とする。このチェックポイント機構を解析することで、外的環境変化および内的リソース蓄積の双方のシグナル伝達系を明らかにすることが可能だと考えられる。申請者の発表・未発表データからODR開始には、明条件・光合成・呼吸・適切な細胞リソースの蓄積の4つの条件が必要であること、これら4つの条件が揃うと、一過的なFHの蓄積、MAPKの活性化、ユビキチン化による特定タンパク質分解の3つの反応が起こりODRが開始されることが明らかになっている。本研究では1) 4つの条件と3つの反応の関連付け、2) MAPKとユビキチン化のターゲットの特定、3) 3つの反応に関わる因子同士の相互作用の解明を行うことでODR開始の分子機構を明らかにする。これらを解き明かすためにRNA-seq、酵母2ハイブリット（Y2H）、MS解析等の大規模解析によるスクリーニングと、個々の因子の機能解析のためにノックアウト・過剰発現株の作成・種々の生化学解析を行う。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度ODR開始機構のキー因子であるFbx1のターゲットの探索を行った。探索はY2Hやプルダウン法によるMS解析では困難であった。そこでin vivoラベリング法を用いODR開始時に細胞内でFbx1近傍に存在するタンパク質のラベリングを行いMS解析による特定を行った。この結果、20ほどのFbx1結合因子をスクリーニングできた。今年度は、in vivoラベリング法を改良しさらなるFbx1結合因子をスクリーニングし、Y2Hでの結合確認の結果6個の新規結合因子を同定した。これらの遺伝子破壊株の作成を試みたが、作成できなかったことから生存に必須な因子であることが考えられた。そこでtag融合株を作成し生化学的解析を進めている。オルガネラシグナルには主に光合成によるシグナルが関与していることを我々は予測していたが、光合成による転写活性化は、光照射後数時間後から始まることがRNAseq解析から明らかになった。そこで、光の波長や照射条件の検討を行った。その過程で、シゾンでは白色光による光転写活性化には2種類のシグナル伝達経路が存在することを発見した。一方は、おそらく光合成をモニターして転写を活性化させる光照射後数時間後から始まる転写活性化、もう一方は青色光特異的な光照射後30分程度で始まる早い転写活性化であった。そこで、青色光特異的反応がオルガネラシグナルに関わる可能性を視野に入れシグナル伝達機構及び下流遺伝子発現の解析を行った。青色光特異的反応にはユビキチン化が関与しており、シグナル伝達に関与するユビキチンライゲース複合体を同定した。このユビキチンライゲースは面白いことにポリユビキチン化ではなくモノユビキチン化酵素でありターゲットである転写因子をモノユビキチン化することで核への移行を誘導することが明らかになった。今後はこの標的遺伝子群にオルガネラシグナル関連因子が存在するか確認する。

Strategy for Future Research Activity

本年度発見した青色光シグナル伝達因子及びその転写因子を用いて下流遺伝子を同定する。また、本年度までに発見された因子と青色光シグナル伝達因子との相互作用を調べオルガネラシグナルとの関連を調査する。さらに本年作成したFbx1結合候補のTag融合株を用いて明・暗、光合成・呼吸鎖・細胞内リソース蓄積の条件でのmRNA及びタンパクレベルの発現解析を行う。また、それぞれの因子のin vivoでの結合を生化学的に検証し、全体の相互作用マップを作成する予定である。