2021 Fiscal Year Research-status Report
同一局在を示す複数のmRNAの局在化機構及び生物学的役割の解明
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20K06639
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
吉田 英樹 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 准教授 (30570600)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | mRNA局在化 / ショウジョウバエ初期胚 / 新生ペプチド鎖 / リボソーム停滞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
mRNAの細胞内局在化の分子機構を解明するため、ショウジョウバエ初期胚において同じ局在パターンを示す5つのmRNA（dia、ani、cno、pyd、smash）の局在化の解明を進めている。申請者らは、これまでに、ani mRNAが自身の翻訳産物を介して、pseudo-cleavage furrow (PCF)と呼ばれる一過性の細胞膜の陥入の先端に局在化することを報告したが、dia mRNAも同様に自身の翻訳産物を介してPCFに局在化することを見出した。更に、アミノ酸配列を調べたところ、リボソームの停滞を引き起こすプロリン残基の連続配列であるポリプロリン配列（PolyP配列）が複数存在することを見出した。このポリプロリン配列を除去したdia mRNA発現系統（ΔFH1系統）では、通常Diaタンパク質の発現が見られない初期胚内部において、Diaタンパク質の異所的な発現が確認された。cno mRNAは、3’非翻訳領域（3’UTR）にステム・ループと呼ばれる二次構造が形成され、そのステム・ループ依存的に局在化している予備的な結果を得ており、ani、dia mRNAとは、異なる機構でPCF先端へ局在化することが予想された。また、pydに関して、初期胚において発現しているスプライスバリアント（splice variant: SV）の同定を行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
dia mRNAのPCF局在には、自身の翻訳が必要であること見出したため、次に、Diaタンパク質のどの領域が重要か、ドメイン欠失系統を作製し解析を行った。その結果、dia mRNAのPCFへの局在化には、N末端側にある細胞膜脂質結合ドメインとGTPase結合ドメインが必要であることが明らかとなった。
dia mRNAのPCF局在化機構の解析と並行し、ΔFH1系統の初期胚内部で見られた異所的な翻訳についても解析を進めた。ΔFH1系統の初期胚内部の異所的な翻訳は、PolyP配列の除去によりリボソームの停滞が起こらず、異所的な翻訳が起きた可能性を考えた。N末端にタグを融合したDiaタンパク質をコードしたmRNAを発現させた初期胚に対し、puro-PLA (proximity ligation assay)を行い、Diaタンパク質の翻訳部位を調べたところ、PolyP配列を除いた系統では、初期胚内部で有意にシグナルの増加が認められた。更に、この胚のタンパク質抽出物を用いてWestern blotを行ったところ、PolyP配列配列でリボソームが停滞した際に予想される75-100kDa付近のバンドが、ΔFH1系統では消失した。これらの結果より、FH1ドメインにあるPolyP配列でリボソームが停滞することが示唆された。このPolyP配列でのリボソームの停滞は、活性型eIF5Aにより乗り越えられることが報告されている。eIF5Aの活性化には、Deoxyhypusine synthase (DHS)とDeoxyhypusine hydroxylase (DOHH)によりハイプシン化される必要があるが、DHSの阻害剤で胚を処理すると、PCFのDiaタンパク質は減少し、また、免疫染色によりDOHHのショウジョウバエホモログとハイプシンが、胚表面において共局在することが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
dia mRNAのPCF局在化の分子機構およびその生物学的役割に関しては、論文化を目指す。また、他のcno、pyd、smash mRNAに関しても、同様にPCFの局在化メカニズムの解析を進める。cno mRNAは、3’UTR依存的にPCFに局在化すると考えていたが、再現性が乏しく、不確定な結果ではあるが、ani、dia mRNAと同じく翻訳依存的に局在化されることが示唆された。興味深いことに、Cnoタンパク質にもPolyP配列配列が有ることから、ani、dia mRNAと共通したメカニズムが働いている可能性が考えらえる。一方で、pyd、smash mRNAのコードするタンパク質にはPolyP配列配列はなく、異なるメカニズムが働いているのかもしれない。こちら2つのmRNAに関しても、発現しているSVの同定、PCF局在に必要なmRNA領域の同定を進める。また、AniのPolyP配列が翻訳の抑制に関わるかを、培養細胞を用いたルシフェラーゼ解析により検討する。
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Research Products
(2 results)
