2021 Fiscal Year Research-status Report
LAPosomeの形成と成熟化の分子機構を明らかにする
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20K06641
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
初沢 清隆 鳥取大学, 医学部, 教授 (20256655)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | LAPosome / LC3 / SNAP-23 / LAP / phagocytosis / phagosome / MORN2 / ALFA-tag |
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| Outline of Annual Research Achievements |
LC3-associated phagocytosis (LAP)において、LC3が局在するLAPosomeは、内部の成熟反応が亢進するがその機構は不明な点が多い。これまでに樹立したLAP関連因子MORN2を過剰発現するLAPosome形成効率の高いマクロファージ（MΦ-MORN2）株を用いて、本研究ではSNARE蛋白質SNAP-23に着目し、MORN2やLC3との関連を解析し「LAPosomeの形成と成熟化の分子機構」を明らかにすることを目的とした。
令和3年度は、昨年度に引き続き計画②「MORN2とSNAP-23の機能的相互作用の解明」を行った。昨年度、抗Myc抗体による免疫沈降実験において弱いながらMORN2とMyc-SNAP-23との相互作用が見られていたが、SNAP-23の機能的関与をより明確にするため、SNAP-23のリン酸化変異体を作成し解析した。構築した細胞株では、非リン酸化型SNAP-23がよりLAPosome膜上に局在しLAPosome形成を促進することがわかった。一方、相互作用については、新たなtagを挿入したGFP-MORN2あるいはMyc-SNAP-23を作成し、発現するMΦ株を樹立した。これらの細胞株について免疫沈降による解析を進めている。
さらに、計画③「LC3とSNAP-23の機能的相互作用の解明」について着手した。前述のMyc-SNAP-23に新たなtag（ALFA-tag）を挿入したMyc-ALFA-SNAP-23シリーズ（リン酸化変異体）を構築し、GFP-MORN2株で発現させたMΦを樹立した。このtagを認識するanti-ALFA nanobodyを用いた免疫沈降条件を検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和３年度は、計画②については、MORN2とSNAP-23の相互作用を明らかにするため、新たにMΦ-MORN2にMyc-SNAP-23の疑似リン酸化型(S95D)と非リン酸化型(S95A)をそれぞれ発現する株を樹立した。今回は、その後の免疫沈降実験の効率を高めるため、ALFA-Nanobodyに認識されるALFA-tagを挿入したMyc-ALFA-SNAP-23シリーズ(野生型、S95D型、S95A型)を構築した。これら変異体の機能解析の結果、S95D型がLAPosome形成やその局在化には抑制的に機能することがわかった。MORN2とSNAP-23の相互作用へのリン酸化状態の影響については、免疫沈降条件の検討を進めている状況である。このMyc-ALFA-SNAP-23シリーズを用いて、計画③のLC3との相互作用も並行して進めている。
一方、ALFA-tagを付加したMORN2も構築し、その発現MΦを樹立した。MORN2とSNAP-23との相互作用および相互作用する因子の網羅的な解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度に作成したMyc-ALFA-SNAP-23シリーズ(野生型、S95D型、S95A型)を発現するMΦ-MORN2株を用いて、計画①では、MORN2依存的なSNAP-23によるphagosome内ROS産生がそのリン酸化修飾の違いで異なるのか、OxyBURST Assay Reagent（サーモフィッシャー社）と免疫染色を組み合わせた実験系により検証する。また、これらの細胞株を用いて計画②のSNAP-23とMORN2の相互作用におけるリン酸化の影響を明らかにする。計画③におけるSNAP-23とLC3との相互作用については、同様にMyc-ALFA-SNAP-23シリーズの細胞株に対しALFA-Nanobodyを用いた免疫沈降実験を行い検証する。
令和3年度に構築したALFA-tagを挿入したGFP-ALFA-MORN2の発現MΦに加え、コントロールとしてGFP-ALFAの発現MΦを樹立する。これらについて、抗GFP抗体やALFA-Nanobodyで免疫沈降することで相互作用因子の網羅的解析を進める。
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| Causes of Carryover |
参加を予定していた学会がオンライン開催になり、旅費の一部が次年度使用となった。
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