2020 Fiscal Year Research-status Report
多能生幹細胞を用いた心肺連携オルガノイド作製技術の開発
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20K06652
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
李 知英 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (20402860)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 心臓オルガノイド / ヒト多能性幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では動物の個体発生に重要な臓器新生(Organogenesis)を試験管内で再現する方法を確立する目的で自己組織化のシグナル経路解明によるヒト多能性幹細胞からの心肺連携オルガノイド作製技術を完成させるとともに、遺伝子発現、組織学、微細構造解析などにより有効なオルガノイド性質評価系を構築を試みた。
先行研究で開発された多能性幹細胞由来心臓オルガノイド作製技術については、心臓特異的遺伝子をノックアウトしたマウスES細胞から心臓オルガノイドは正常な心筋形成ができないことを実証する研究を追加で行うことにより、マウスES細胞由来構造的・機能的心臓オルガノイド作製法を確立した。
また、マウスES細胞由来心臓オルガノイド作製技術を基盤にヒトES細胞由来心臓オルガノイド作製を試み、成功した。特に、FGF4シグナルだけではなくマウス胎児の心臓で発現するBMP10を添加することで形態変化の精度が高い心臓オルガノイドを作製できた。これらの心臓オルガノイドは胎児型心臓に形が類似していて、蛍光免疫染色によって心筋細胞のマーカーを発現していることが明らかとなった。特にこれらのヒトES細胞由来心臓オルガノイドに置いてNa電流とCa電流が確認され、各電流のパターンはナイーブな心臓に極めて似ていることが明らかとなった。
さらに、ヒト多能性幹細胞からの心肺連携オルガノイド作製技術を確立するためには、マウス生体における肺発生のシグナル因子の中のFGFシグナルと、そのシグナルの働きを干渉する阻害剤を用いて、試験管内で心臓と肺の発生を試み、ROCK阻害剤が肺オルガノイド作製に重要であることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和２年度にはマウスES細胞由来心臓オルガノイド作製技術を基盤にヒトES細胞から心臓オルガノイドを作製することに成功した。この研究の遂行の中でFGF4シグナルだけではなくマウス胎児の心臓で発現するBMP10を添加することで形態変化の精度が高い心臓オルガノイドを作製できた。これらの心臓オルガノイドは胎児型心臓に形が類似していて、蛍光免疫染色によってMlc2a, Mlc2vなどの心筋細胞のマーカーを発現していることが明らかとなった。
特に、心臓の機能に重要な役割を果たすイオンチャンネルについてPatch clamp解析で、これらのヒトES細胞由来心臓オルガノイドに置いてNa電流とCa電流が確認された。上述電流のパターンはナイーブな心臓に極めて似ていることで、心臓オルガノイドの技術的応用がより現実的になって来たことを意味する。
また、肺および心肺オルガノイド作製条件検討に用いたROCK阻害剤はヒトES細胞由来オルガノイドにおいて心臓だけではなく肺発生も促進する様な結果が得られたので、当初の計画どおり「ヒト多能性幹細胞由来の心肺オルガノイド作製に有効な自己組織化シグナル経路の探索」を達成できたと思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の結果で得られたヒト多能性幹細胞由来肺および心肺オルガノイド作製条件を最適化すると共にこれらのオルガノイドにおいて総合的評価を行う。具体的には、最適条件で作製された肺オルガノイドを用いてRNA-seq（次世代シーケンシング）解析を行い、網羅的遺伝子解析を用いた肺関連遺伝子のプロファイルの作成し、作製された肺オルガノイドが生体の肺とどれ位類似性を持つのか明らかにする。
また、 抗体を用いた蛍光免疫染色によって肺オルガノイドにおいて組織学的解析を行い（転写因子、気管上皮マーカー、I型肺胞上皮細胞やII型肺胞上皮細胞マーカー等）、電子顕微鏡を用いた微細構造解析によって作製された肺オルガノイドが、I型肺胞上皮細胞、II型肺胞上皮細胞や肺機能に重要な界面活性物質を分泌するクララ細胞など肺特異的細胞の微細構造を持つか調査する。
さらに、ヒトES細胞由来心臓オルガノイドの成熟度を向上させるための方法として、Wntシグナルを抑制する小分子阻害剤の役割を検証する。この方法で作製された心臓オルガノイドの形態、微細構造、機能的評価をこれまで確立された実験系を用いて行う。
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| Causes of Carryover |
（理由）
学会はオンラインでの参加であったため、旅費の使用が無く、その他の使用が少なかったため、次年度使用額が生じた。
（使用計画）
次年度使用額は（受託解析料や実験機器セットアップ費用等）または物品費として使用する予定てある。
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Research Products
(4 results)
