2020 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of Neurod1-expressing cells druing pancreatic beta cell regeneration
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20K06660
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
松田 大樹 立命館大学, 生命科学部, 助教 (60801363)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 膵β細胞 / 再生 / 細胞系譜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膵臓ランゲルハンス島β細胞(以降、β細胞)が損なわれると、我々哺乳類はこの細胞を再生できないため糖尿病を発症する。興味深いことに脊椎動物の中でゼブラフィッシュはβ細胞の再生を行うことできる。この動物のβ細胞再生機構の解明は糖尿病治療の開発に大きく寄与できる。本研究は、これまで知られていなかった再生してくるβ細胞の主要な起源となる細胞と思われるNeurod1発現細胞（以降、Ｎ１細胞）からどのようにして新たなβ細胞が再生してくるのかその細胞分子メカニズムの明らかにすることを目的にしている。
この目的のために、かつてN1細胞であった細胞を追跡できるシステムを構築する必要がある。そこで2020年度は、N1細胞のみにタモキシフェン(TAM)誘導型Cre組み換え酵素（CreERT2）を発現するトランスジェニ ック（以降、TG)系統（neurod1:CreERT2）、およびCreレスポンダーTG系統（insulin:loxp-mCherry-loxp-eGFP）を作製もしくは入手し、この2種類のTG系統を交配させてTAMを加えることで、N1細胞に由来するβ細胞のみがeGFPの発現によって追跡できるシステムの構築を計画した。
まずneurod1プロモーターをワシントン大学David Raible教授から入手し、トランスジェニック作製用neurod1:CreERT2コンストラクトの作製を行い、I-SceIシステムを使いTG系統のneurod1:CreERT2作製を行った。さらに、insulin:loxp-mCherry-loxp-eGFP TG系統についてはマックスプランク心臓肺研究所Didir Stainier教授から入手した。この2系統を掛け合わせ、neurod1:CreERT2/ insulin:loxp-mCherry-loxp-eGFPの作製に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予定では、neurod1:CreERT2/insulin:loxp-mCherry-loxp-eGFPというダブルTG系統を作製しその表現型の解析を行う予定であったが、作製までは出来たが、解析まで行うことができなかった。理由とすると、neurod1:CreERT2系統の作製の際、本来BACリコンビニアリングの技術を利用し作製する予定であったが、新型コロナ影響もあり、BACリコンビニアリングに必要な一部試薬の入手が困難であったため、その実験の取りかかりに遅れてしまったためである。その後運よく、neurod1遺伝子の5キロ上流のプロモーター領域で代替できることがわかり、この遺伝子断片の入手も行うこともでき、結果年度内に解析までは出来なかったが、neurod1:CreERT2/ insulin:loxp-mCherry-loxp-eGFP系統の作製するまでは成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
作製に成功したneurod1:CreERT2/insulin:loxp-mCherry-loxp-eGFP系統を用い、β細胞再生時の表現型解析を行い、新生β細胞におけるN1由来細胞の占有率を算出し、N1細胞のβ細胞の再生への寄与を明確にする。
さらに当初の計画通り、生理活性が知られている低分子化合物を、このダブルTG系統に投与しスクリーニングを行い、N1細胞からβ細胞に転換させる化合物を見出し、ヒット化合物の性質からどのようなシグナル経路がβ細胞の再生に影響を与えるのか明らかにする。
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| Causes of Carryover |
作製したダブルTG系統の表現型解析に必要な試薬ならびに備品の購入に使用する予定であったが、実験が遅れたため当該年度では使用できなかったため次年度使用額が生じた。
このダブルTG系統はすでに作製しており、この次年度使用額を用い試薬ならびに備品の購入し、次年度初頭に以上の表現型解析を行う予定である。
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