2021 Fiscal Year Research-status Report

力学刺激が活性化するプロテインキナーゼ群による初期胚外胚葉の間葉上皮転換様制御

Research Project

Project/Area Number	20K06663
Research Institution	National Institute for Basic Biology
Principal Investigator	木下典行基礎生物学研究所, 形態形成研究部門, 准教授 (30300940)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	密着結合 / ZO-1 / 力学刺激
Outline of Annual Research Achievements	アフリカツメガエル原腸胚の外胚葉にストレッチ刺激を与えるとタンパク質リン酸化に大きな変化が現れることを、質量分析によるリン酸化プロテオミクス解析により見出した。その中でもタイトジャンクションの構成タンパク質のリン酸化が大きく変化していた。本研究では、機械刺激によってリン酸化状態が変化するタンパク質として、タイトジャンクション構成タンパク質の一つであるZO-1タンパク質に注目した。ZO-1タンパク質は、刺激によりリン酸化されるとともに、細胞内局在も変化する。すなわち、刺激前は細胞質で顆粒状に存在し、刺激によりタイトジャンクションへと移行することがわかった。興味深いことに、ZO-1の細胞質顆粒は、液液相分離（LLPS）によって形成されることも確認された。ZO-1の細胞質顆粒は、アフリカツメガエル胚だけでなく、マウス胚や培養細胞系でも力学刺激依存的なLLPSが観察された。現在、近位依存的ビオチン化のシステムを用いて、細胞質顆粒内でZO-1と共局在するタンパク質の同定を開始している。ビオチン化酵素遺伝子をZO-1遺伝子と融合し、細胞質顆粒とタイトジャンクションに局在させた時にビオチン化されるタンパク質を質量分析により同定し、細胞内局在による違いを解析する手法である。予備的な結果であるが、候補タンパク質には複数のプロテインキナーゼタンパク質が含まれており、今後確認実験を行なっていく予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2021年度は、機械刺激によってリン酸化状態が変化するタンパク質ZO-1タンパク質に注目して研究を行い、ZO-1タンパク質は、刺激によりリン酸化されるとともに、細胞内局在も変化することを発見した。興味深いことに、ZO-1は液液相分離（LLPS）によって細胞質顆粒を形成することがわかった。これらの結果はiScienceの論文として報告した。さらに、この細胞質顆粒にはプロテインキナーゼが含まれていることを示唆する結果を得ており、今後の研究に展開する基盤ができた。
Strategy for Future Research Activity	近位依存的ビオチン化システムによってZO-1と共局在することが示唆されたプロテインキナーゼについて培養細胞を用いてvalidation実験を行う。また、プロテインキナーゼの阻害剤や遺伝子ノックダウンなどの手法により、ZO-1のLLPSや力学応答への影響を調べて、プロテインキナーゼの機能を明らかにする。またマウス胚を用いて、これらのプロテインキナーゼの細胞内局在や、力学刺激応答における役割を追究する。
Causes of Carryover	これまで分子生物学関連の研究を主にしてきたので経費的に少なく偏りが生じたが、今後は質量分析の受託、マウスの飼育やノックアウト株の作成などで経費がかかる予定である。