四肢再生特異的に働く転写因子を起点とした再生駆動機構解明とカエル成体の再生能回復

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06664
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 川住 愛子 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (80625484)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 四肢再生 / 形態形成 / ゲノム編集 / トランスクリプトーム解析 / アフリカツメガエル / ネッタイツメガエル / RNA-seq

Outline of Annual Research Achievements

アフリカツメガエルは高い再生能力をもっており、幼生期に四肢を切断しても完全に再生することができる。このアフリカツメガエル幼生の四肢再生・発生過程における形態形成期についてRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行った結果、再生領域特異的に発現上昇する遺伝子10個が同定された。
この10個のうち最も発現量の差が大きい2つの候補遺伝子(X1, X2)について、Crispr-Cas9系を利用したゲノム編集による機能解析(Loss of Function)を2 倍体であるネッタイツメガエルに対して行い、遺伝子X1, X2の変異個体(幼生)について四肢再生が異常になる表現系（四肢発生には全く異常が見られない）が得られていた。また、熱ショック応答により遺伝子X1, X2発現を誘導できるTransgenicアフリカツメガエル個体を作製し、四肢再生領域でX1, X2を過剰発現させることによってこれら遺伝子の機能解析(Gain of Function)を行っており、後肢切断を行い再生させたところ、先端が2~3本に分岐した軟骨をもつ器官が再生するという表現系が得られている。
本年は遺伝子X1のゲノム編集F2個体(幼生)の四肢再生における形態形成遺伝子発現の確認をRNAscopeとリアルタイムPCRによって行った。また遺伝子X1の過剰発現個体(変態後の幼若個体)においてもリアルタイムPCRによる形態形成遺伝子発現量の定量を行った。さらに、 遺伝子X1のゲノム編集F2個体(幼生)/過剰発現個体(変態後の幼若個体)の四肢再生において、自脚部の低形成/再生部位の膨大がそれぞれ確認されたため、 形態変化が現れる少し前の再生部位における細胞増殖パターンをリン酸化ヒストンH3の免疫染色によって確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画の通りに実験を遂行できた。得られた結果に関しても、概ね予想通りであった。
以上より、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

これまでに得られた結果をまとめた論文を作成する。
今後は遺伝子X1, X2の下流シグナルの詳細解析と、ツメガエル再生過程における細胞多様性の解析を行う。
また、X1, X2過剰発現アフリカツメガエル（変態後の幼若個体）と野生型の四肢再生部位の培養を行い、軟骨細胞パターンの比較を行う。

Causes of Carryover

COVID-19の影響lにより学会参加費がなくなり、旅費の支出が0となった。