Isolation of neighboring cell-interacting factors in plants

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06669
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 久保 稔 奈良先端科学技術大学院大学, デジタルグリーンイノベーションセンター, 特任准教授 (30342778)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 細胞間相互作用 / 次世代シーケンシング / 1細胞解析 / 幹細胞 / 頂端細胞 / 仮根 / 環境応答

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、隣り合った1個1個の細胞の遺伝子の働きを調べることで、植物細胞間の相互作用で働く遺伝子を探索し、それらの働く仕組みを明らかにすることを目的としている。本年は以下の３つのアプローチによる近接細胞間相互作用因子の探索を試みた。
ヒメツリガネゴケの切断葉では、切り口に面した葉細胞の幾つかがリプログラミングし、幹細胞である頂端細胞となる。加えて、周囲の細胞を削除し、孤立させた１細胞にするとそのほとんどがリプログラミングする。そこでこれらの「孤立させた１葉細胞」を調整し、幹細胞となる細胞の計時的な１細胞トランスクリプトーム解析を行った。
コケ植物であるオオミズゴケの葉は一層の細胞からなり、らせん状の細胞壁肥厚を持つ透明細胞を取り囲むように葉緑細胞が形成される。これら２種類の葉細胞が秩序だった細胞分化を行うためには何らかの細胞間相互作用が必要である。そこでこの過程に関わる分子機構を明らかにするために、オオミズゴケの葉原基に近い幼葉からプロトプラストを調整し、それらを用いた１細胞トランスクリプトーム解析を行った。
ヒメツリガネゴケの仮根は、頂端細胞とそれに続く細胞からなり、非対称分裂を行うことで形成され、これらの細胞は外部環境に応答しその生長が制御される。そこで非対称分裂と環境応答の関係を明らかにするために、藤田知道教授（北海道大学）らとともに、異なる環境条件で育成したヒメツリガネゴケ仮根からその先端細胞を含む数細胞を採集し、それらから1cell-DGEの手法を応用したNGSライブラリーを作成した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒメツリガネゴケ切断葉において「孤立させた１葉細胞」を調整し、葉切断後6、12、24、38時間目において個別にサンプリングし、1cell-DGE法によるNGSライブラリーを作成した。これらとこれまでに取得済みである0hの葉細胞データを用いて、計時的な１細胞トランスクリプトーム解析を行った。
オオミズゴケの葉原基に近い幼葉からプロトプラストを調整し、細胞の大きさおよび、内在する葉緑体を指標に葉緑細胞および透明細胞由来と区別できるプロトプラストを１個ずつ回収し、1cell-DGE法によるNGSライブラリーの調整を行った。それらを用いた１細胞トランスクリプトーム解析を行った。
非対称分裂と環境応答の関係を明らかにするために、異なる環境条件で育成したヒメツリガネゴケ仮根からその先端細胞を含む数細胞を採集し、それらから1cell-DGEの手法を応用したNGSライブラリーを作成した。

Strategy for Future Research Activity

得られたトランスクリプトームデータについて検証し、最新のリファレンスデータを用いたマッピング、及びリード計数を行う。その後、１細胞解析用に開発されたパッケージを用いた多変量解析、細胞系譜解析を行い、近接細胞間で働く遺伝子候補を同定する。
ヒメツリガネゴケにおいては、得られた候補遺伝子について、ノックアウトやノックインラインを作成し、細胞分化もしくはリプログラミング時に影響がないかを観察する。オオミズゴケについては、in situハイブリダイゼーション法を確立し、これら遺伝子の局在について検証する。

Causes of Carryover

次世代シーケンサーを用いた1細胞トランスクリプトーム解析の一部を次年度に実施することにしたため、それにかかる費用を繰り越した。