Isolation of neighboring cell-interacting factors in plants

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06669
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 久保 稔 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 特任准教授 (30342778)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 細胞間相互作用 / 次世代シーケンシング / 1細胞解析 / リプログラミング / 幹細胞 / 透明細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、隣り合った1個1個の細胞の遺伝子の働きを調べることで、植物細胞間の相互作用で働く遺伝子を探索し、それらの働く仕組みを明らかにすることを目的としている。本年は以下の２つのアプローチによる近接細胞間相互作用因子の探索を試みた。
ヒメツリガネゴケの切断葉では、切り口に面した葉細胞の幾つかがリプログラミングし、幹細胞である頂端細胞となる。加えて、周囲の細胞を削除し、孤立させた１細胞にするとそのほとんどがリプログラミングする。そこでこれらの「孤立させた１葉細胞」を調整し、幹細胞となる細胞の計時的な１細胞トランスクリプトーム解析を行った。得られたデータを元に多変量解析を行った結果、リプログラミングする細胞の高解像度の遺伝子発現プロファイルを得ることができ、リプログラミングする細胞内ではそれに関わるイベントが連続的に起こっていることが明らかとなった。
コケ植物であるオオミズゴケの葉は一層の細胞からなり、らせん状の細胞壁肥厚を持つ透明細胞を取り囲むように葉緑細胞が形成される。これら２種類の葉細胞が秩序だった細胞分化を行うためには何らかの細胞間相互作用が必要である。そこでこの過程に関わる分子機構を明らかにするために、オオミズゴケの葉原基に近い幼葉からプロトプラストを調整し、それらを用いた１細胞トランスクリプトーム解析を行った。 得られたデータを元に多変量解析を行った結果、透明細胞での発現が顕著な遺伝子群が明らかとなった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ヒメツリガネゴケの切断葉を用いた研究においては、再現性の高いリプログラミング条件の検討に時間がかかったため、それを用いた新たなサンプル調整、および、１細胞とランスクリプトーム解析のためのデータ取得に時間を要した。
オオミズゴケの未分化葉細胞のプロトプラスト採集については、オオミズゴケの生育が遅いため多量のサンプル調整が難しいことから追加のデータ収集に時間を要している。また、国際植物ゲノムデータベース"Phytozome"に最近、完全公開されたミズゴケ属の一種、Sphagnam falaxの最新ゲノムリファレンスをもとにして、遺伝子プロファイルの再構築を行う必要があった。

Strategy for Future Research Activity

得られたトランスクリプトームデータについて検証し、最新のリファレンスデータを用いたマッピング、及びリード計数を行う。その後、１細胞解析用に開発されたパッケージを用いた多変量解析、細胞系譜解析を行い、近接細胞間で働く遺伝子候補を同定する。
ヒメツリガネゴケにおいては、得られた候補遺伝子について、ノックアウトやノックインラインを作成し、細胞分化もしくはリプログラミング時に影響がないかを観察する。オオミズゴケについては、in situハイブリダイゼーション法を確立し、これら遺伝子の局在について検証する。

Causes of Carryover

次世代シーケンサーを用いた1細胞トランスクリプトーム解析の一部を次年度に実施することにしたため、それにかかる費用を繰り越した。