2021 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of cell differentiation by novel autophagy regulators
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20K06672
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| Research Institution | Sophia University |
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Principal Investigator |
山田 葉子 上智大学, 理工学部, 准教授 (80859695)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川田 健文 東邦大学, 理学部, 教授 (30221899)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞分化 / オートファジー / 細胞性粘菌 / 進化発生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オートファジー調節因子KnkAおよびBcas3の分子機能と細胞分化における役割の進化的変遷を明らかにする目的で実験を行った。両因子の機能はこれまで細胞性粘菌の進化系統グループ4に属するDictyostelium discoideum (Ddis)において明らかにされてきた。今回系統グループのそれぞれ異なるPolysphondilium violaceum (Pvio) およびP. pallidum (Ppal)におけるknkA, bcas3遺伝子破壊を試み、Ppal bcas3を除く目的の欠損株を得た。Ppalは最初いずれの欠損株も得られなかったが、形質転換プロトコールの最適化を行い、knkAを破壊することができた。得られたPvio, Ppalの knkA, bcas3欠損株について表現型を解析したところ、柄細胞分化の促進と柄基部の肥大化などDdis欠損株との共通性が見られた一方、Ddis欠損株で顕著であった胞子形成異常は部分的にとどまるといった違いも見られた。
他の生物における機能保存性についても調べる目的で、マウス及びシロイヌナズナのオーソログをDdis遺伝子欠損株で発現し、表現型の相補の有無を検討した。初年度の結果に基づきベクターを適切化した発現用コンストラクトを構築し、計画したほとんどの形質転換株を得た。現在表現型の解析を進めている。
一方、オートファジー調節因子の分解を任意に調節してそれらの機能を調べる目的で細胞性粘菌におけるオーキシンデグロン系の構築を目指した。マーカーとしてEGFPに最小デグロンmAIDを付加したものとオーキシンデグロンデグロン系構成因子イネTIR1(F74G)を安定に発現する株を得た。この株を用いてオーキシン誘導体を添加してmAID-EGFPの分解を誘導できたが、オーキシン非添加でもある程度分解が起こってしまい条件検討が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度において、コロナウイルス感染症にともなう研究自粛、および研究代表者の機関異動に伴う断続などにより、中心課題の進行に遅れが生じた。令和３年度にはある程度の進展があったが、総合的にはまだ「やや遅れている」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
KnkA, Bcas3の分子機能解析とその進化的変遷の理解を目的とした研究計画を継続する。Ppal bcas3欠損株など未作成の株を得るべく実験を進める。Ppal bcas3については従来の相同組換え法と共に、新たにゲノム編集による遺伝子改変も試みる。一方すでに得られたknkA, bcas3欠損株や、多生物オーソログ発現株について、遺伝子発現など表現型のさらなる解析と、KnkA, Bcas3の細胞内局在、複合体形成などの解析を行う。表現型が培養条件によって変化することを示唆する結果を得ており、情報経路を明らかにする目的に沿って詳細な解析を行う。
一方分化誘導に働くcAMPシグナルの情報経路についてBioIDを用いた受容体結合タンパク質の生化学的解析を当初より計画していたが、予定していたBirAタンパク質はBioIDにおける反応が遅く、本研究目的には不適切だと判断された。これに代えてTurboIDを使用することとし、コドンを最適化した遺伝子を作成のうえ適切な発現ベクターを構築し、実験を進める。
mAID-EGFPの分解のオンオフを正確に制御できるように条件検討をする。オートファジー調節因子にmAIDを付加し、イネTIR1(F74G)と共発現する株を作製し、分解を誘導することで機能解析を行う。
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| Causes of Carryover |
初年度におけるコロナ感染症及び研究代表者の機関異動と職務変更に伴う研究の遅れの影響で、次年度使用額が生じた。 令和４年度には、当初令和３年度までに計画していた内容を含め、研究を継続して進めていく。そのための物品費等として令和3年度請求分と合わせて使用する予定 である。
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