マウス大脳皮質発生過程でのCa2+依存的低濃度Shhシグナル伝達経路の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06674
• Research Institution: Doshisha University
• Principal Investigator: 元山 純 同志社大学, 脳科学研究科, 教授 (70321825)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: マウス胚 / イオンチャネル / 神経幹細胞 / 細胞分裂分化 / 細胞内Ca2+シグナル

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、Ca2+イメージングを用いてマウス胚大脳皮質の発生過程での細胞内Ca2+濃度変動を記録し神経前駆細胞の細胞分裂・分化とCa2+濃度変動パターンの関係の解明を目的とする。昨年度までの研究により、分裂中の神経幹細胞では比較的高濃度の細胞内Ca2+濃度を示すが一過的な濃度変動は示さないこと、一方分化決定後の神経前駆細胞では細胞内Ca2+濃度の低下が見られ、かつ一過的なCa2+濃度変動が発生し始めること、その一過的Ca2+濃度変動は分化が進むにつれて高頻度になることを発見した。これらの発見を踏まえ、神経前駆細胞の発生過程における細胞内Ca2+濃度変動パターンを人為的に操作した際の、神経前駆細胞の発生運命に与える影響を調べた。現在までに①in vitro sphere培養下でのCa2+濃度変動の阻害をT-type Ca2+イオンチャネル阻害剤であるNNC55-0396を用いて行なった。更に②in vivoでの神経前駆細胞の分裂と分化過程においてT-type Ca2+イオンチャネルのサブユニットであるCav3.1又はCav3.2のRNAi導入によるノックダウン実験を実施した。その結果、実験①によって、NNC55-0396の作用によって神経前駆細胞の細胞分裂が促進されたこと、その一方でsphere内部における幼弱神経細胞数が減少したこと、NNC55-0396の作用によって一次sphereから生じる二次sphereの形成数が増加することがわかった。また実験②によって、Cav3.1ノックダウンが生じている神経前駆細胞では、Pax6陽性細胞からTbr1陽性細胞への分化が進行せず、Pax6陽性細胞のまま分裂を継続すること、Cav3.2ノックダウンが生じている神経前駆細胞では、Pax6陽性細胞からTbr1陽性細胞への分化が進行していることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度までに明らかとなった、分化決定後の神経前駆細胞で一過的なCa2+濃度変動が発生し始めることについて、今年度では生理的な役割の検討をおこなった。具体的には①一過的Ca2+濃度変動に関わるイオンチャネルの同定、そのイオンチャネルの阻害による細胞分化への影響をin vitroの細胞培養系で解析した。その結果、様々なCa2+イオンチャネルの阻害剤を用いることで自発的Ca2+濃度変動が、T-type Ca2+イオンチャネルに依存していることを明らかにした。更に、in vitro sphere培養系を用いて特異的なT-type Ca2+イオンチャネル阻害剤であるNNC55-0396の作用によって神経前駆細胞の細胞分裂が促進されたこと、その一方でsphere内部における幼弱神経細胞数が減少したこと、NNC55-0396の作用によって一次sphereから生じる二次sphereの形成数が増加することがわかった。これらの結果はT-type Ca2+イオンチャネルに依存した一過的細胞内Ca2+濃度変動が神経前駆細胞の細胞分化に必須であることを示唆している。加えて②細胞内Ca2+濃度変動パターンを人為的に操作し、神経前駆細胞の発生運命(細胞分裂や分化)に与える影響を調べるin vivo実験をおこなった。興味深いことにCav3.1ノックダウンが生じている神経前駆細胞は幼若神経細胞への分化が進行せず、神経前駆細胞のまま分裂をおこなっていることを発見した。更にCav3.2ノックダウンが生じている神経前駆細胞では、幼若神経細胞への分化が速やかに進行していた。これらの結果は、Cav3.1に依存したT-type Ca2+イオンチャネルが神経前駆細胞での自発的細胞内Ca2+濃度変動に必要であり、その発的細胞内Ca2+濃度変動が神経前駆細胞から幼若神経細胞への分化に必要であることが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

今後は自発的細胞内Ca2+濃度変動の惹起に関わる細胞間相互作用を行う因子の同定を試みる。具体的にはソニックヘッジホッグ等既に同定されている細胞外シグナル伝達因子について、特に神経前駆細胞から幼若神経細胞への分化に関わるプロセスに注目し、in vitro Ca2+ imaging下でそれらシグナル伝達因子を作用させ、神経前駆細胞が示す自発的細胞内Ca2+濃度変動パターンへの影響を観察する。そこでの結果からin vivoでの検討を実施する対象となるシグナル伝達因子を絞り込む。

Causes of Carryover

初年度コロナ禍に伴う研究活動の制限があった分の執行残がある。コロナ禍による制限は引き続き存在するが、着実に研究活動は継続できている。次年度での支出によって上記課題の達成を行う。

Remarks

論文投稿後修正依頼あり、現在再投稿後返事待ち