2020 Fiscal Year Research-status Report
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20K06686
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
草野 博彰 京都大学, 生存圏研究所, 研究員 (80447929)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 二次代謝 / メタボローム解析 / トランスクリプトーム解析 / BAHDアシル基転移酵素 / イチイ / タキサジエン系化合物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イチイ培養細胞のトランスクリプトームおよびメタボローム情報解析を行い、これを基にアシル基転移酵素遺伝子群を単離し、酵母を使って酵素活性を解析した。この実験に３種類の基質化合物を供試したところ７位と９位に水酸基を持つ13-acetyl 9-hydroxy baccatinIII をアセチル化できる酵素遺伝子がみつかった。この酵素は10位に水酸基を持つ10-deacetyl baccatinIII からbaccatinIIIを合成できることもわかった。これらのことから、この酵素は多様なタキサン化合物、多様なアセチル化部位を基質とすることができる新規な酵素であることが示唆された。
イチイ培養細胞のメタボロームを従前の21日間より長い43日間についてモニターしたところ、培養上清におけるタキサジエン系化合物の組成に未知の変化が見いだされ、特にパクリタキセルの生成につながるものが35日前後に大きく変化していたことがわかった。このような分析サンプル間の差をもつ化合物シグナルを効率的に同定するために、新たにメタボローム分析ソフトウェアを開発した。
イチイ培養細胞のトランスクリプトーム解析から得た塩基配列のうち、アシル基転移酵素のBAHDファミリーについて解析したところ、既知のタキサジエン系化合物代謝酵素と非常に近縁な、互いに部分的に同一の塩基配列をもつ未知遺伝子群の存在が示唆された。このため、さらに効率的にタキサジエン系化合物の代謝に関わる遺伝子を単離するには、ロングリードシーケンサーを併用した精確なコンティグアセンブリが有効であると考えられた。そこで高速計算が可能な計算機環境を整備した。
この他、ウイルスベクターや遺伝子導入技術についてモデル生物を使った予備実験、また植物の物質蓄積機能の調節因子の解析などを実施した。これらの成果については論文等で発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
初年度である今年度の計画については概ね計画通りに進行した。さらに次年度以降の研究に利用できる新たな技術の開発や生命現象の発見に成功したので当初計画以上に進展したと考えられる。
年次計画として、１年目は主にオミックス解析と遺伝子の探索、２年目は主に生理学的な遺伝子機能解析、３年目は主に細胞生物学・生化学的な遺伝子機能解析が計画されている。研究計画全体の目的はタキサジエン系化合物の生合成の空間的な調節に関わる代謝酵素や輸送体など遺伝子の同定である。このうち今年度は計画通りに、トランスクリプトームとメタボロームの統合オミックス解析、およびそれにより見出した遺伝子について酵母等を利用した機能解析を実施した。その成果としてBAHDアシル基転移酵素ファミリーからタキサジエン系化合物をアセチル化する新規な酵素を単離した。これに加えて、メタボローム解析では培養後期にタキサジエン系化合物の代謝系が変化することを新たに見出した。この期間についてトランスクリプトーム解析を実施することで新たに関連遺伝子が見つかる可能性がある。また、トランスクリプトーム解析ではタキサジエン系化合物の代謝機能に関わる遺伝子ファミリー内に塩基配列の重複が多く見いだされた。このことから、より精確なde novo コンティグアセブリを実施することで遺伝子の同定やcDNAクローニングを効率化できる可能性がある。そこでロングリードシーケンサー等を利用した情報解析のための計算機環境を整備した。さらに、各オミックス情報解析に利用できるソフトウェアの開発や、モデル植物を利用したウイルスベクター系の開発などに成功した。これらの新規技術はさらなる候補遺伝子の単離や次年度以降に計画している機能解析に利用できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初計画どおりの遺伝子機能解析に加えて、初年度に新たに開発したウイルスベクター系なども活用して効率的に研究を推進する。初年度までにタキサジエン系化合物の生合成との関係が示唆された遺伝子については、GFP融合タンパク質の蛍光の追跡などの計画を前倒して実施し、その性質の解明を目指す。さらに、初年度に整備した情報解析環境を利用して、以下のように、さらなる未知遺伝子の単離を試みる。
イチイ培養細胞の長期間培養について、培養上清だけでなく細胞における物質蓄積の時間的変化をメタボローム解析でモニターする。新たに開発したメタボローム解析ツールを利用することで多数のサンプル間の比較が可能になったので、これを利用して培養系全体でのタキサジエン系化合物生合成の変化を把握する。これとトランスクリプトームの変化との統合解析を実施し、タキサジエン系化合物の生合成に関わる未知の酵素遺伝子や輸送体などのさらなる同定を目指す。また、このメタボローム解析ツールについてはインターネット上での公開を目指して開発・整備する。
イチイのトランスクリプトームについては今年度の研究から、タキサジエン系化合物の生合成に関わる遺伝子には長い重複部位が含まれることが考えられ、ショートリードデータのアセンブルでは誤った交差が出現していると考えられた。この修正にはロングリードシーケンサーによる解読データやゲノムデータを併用し、これまでに整備した高速計算機環境と、必要なら新たなアルゴリズムを開発して塩基配列をアセンブルする。また、メタボローム解析で急激な変化が認められた35日前後の発現量の変化を観察するため、サンプルを採取しメタボロームとの統合解析に供する。また、リアルタイムPCR等を利用した解析でより高精細なタイムコースの観察を試みる。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症対策のため学会がオンライン開催となり旅費の支出が発生しなかったため。Oxford Nanopore MinION starter pack 等、購入を予定していた物品の一部について納品が遅れたため。納品が遅れた物品については次年度に購入する。
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[Journal Article] Apple latent spherical virus (ALSV)-induced gene silencing in a medicinal plant Lithospermum erythrorhizon2020
Author(s)
Izuishi Yuki, Isaka Natsumi, Li Hao, Nakanishi Kohei, Kageyama Joji, Ishikawa Kazuya, Shimada Tomoo, Masuta Chikara, Yoshikawa Nobuyuki, Kusano Hiroaki, Yazaki Kazufumi
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 10
Pages: 13555
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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