2020 Fiscal Year Research-status Report
植物細胞の分裂期微小管構造体の動態を制御する分子機構の研究
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20K06696
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
笹部 美知子 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (00454380)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
町田 泰則 名古屋大学, 理学研究科, 名誉教授 (80175596)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 細胞分裂 / 微小管 / 紡錘体 / フラグモプラスト / キネシン / 微小管結合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物の細胞分裂は、前期前微小管束（Pre-prophase band; PPB）や中心体を持たない中期紡錘体、そして細胞質分裂装置である隔膜形成体（フラグモプラスト）と呼ばれる植物細胞に特異的な微小管構造体を介して実行される。しかし、これらの構造体が形成される仕組みや、分裂の過程で連続的でダイナミックな構造変換を制御する仕組みについては不明な点が多い。シロイヌナズナのキネシン14ファミリー (Kin14)は多数のメンバーから構成され、分子機能も多岐に渡ることが予想されているが、我々はこれまでの研究から、特定のKin14 メンバー（Kin14A及びKin14B）が分裂期の様々な微小管構造体に局在し、分裂の過程でこれら構造体の動態制御に関与している可能性を見いだしている。今回、これらタンパク質の推定機能ドメインのアミノ酸に変異を入れたコンストラクトを作製し、培養細胞において過剰発現させたところ、いくつかの変異体の過剰発現により中期紡錘体及びフラグモプラストの形状が異常となり細胞分裂の様々な段階で異常が生じることが分かった。これらの異常を分裂期ごとに詳細に解析した結果、本因子は分裂期の段階に応じて特異的な翻訳後修飾または相互作用因子を介してそれぞれの微小管構造体の構造と機能を制御している可能性が示唆された。そこで、免疫沈殿法により、これらキネシンの相互作用因子の探索を行ったところ、複数のタンパク質が共沈殿されることが明らかになった。今後、これら相互作用因子の実態を明らかにしていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、Kin14A及びKin14Bの基本的な細胞学的な性質を解析し、これら因子が細胞分裂期の微小管構造の維持に重要な役割を果たしていることを明らかにすることができた。また、生化学的に相互作用因子の解析を進め、複数の相互作用因子が存在していることも分かった。さらに、相互作用因子の解析では、従来の免疫沈殿法に加えて近接依存性標識法による方法も同時に進めており、今年度コンストラクトの作成まで修了している。今後、これらの方法を組み合わせて解析を進めることによりそれぞれのタンパク質の分裂期特異的な相互作用因子を明らかにすることができると考えている。このように、研究はおおむね当初の計画通りに順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
着目しているキネシンについて、基本的な細胞生物学的性質が明らかになってきたので、微小管に対する結合活性やモーター活性を試験管内で解析し、それぞれの因子の生化学的特性を明らかにする。また、免疫沈殿法により精製したKin14A及びKin14Bの相互作用因子について、質量分析により同定を進める。近接依存性標識法による解析についても、作製した各種コンストラクトを培養細胞及び植物体に導入し、同時に解析を実施する予定である。これらの方法により同定したKin14A、14Bの制御因子や相互作用因子の細胞分裂における機能解析を、細胞生物学的手法や遺伝学的手法を用いて進める。さらに、両因子が分裂周期に依存した翻訳後修飾により多機能性が付与されている可能性を検証するために、同調培養した培養細胞から抽出、精製したKin14A、14Bについて質量分析によるタンパク質翻訳後修飾プロファイリングを行う。分裂前期、中期、終期における翻訳後修飾を比較し、それぞれのフェーズ特異的な修飾が存在した場合、その修飾が付与する機能を修飾に応じて解析を進める。これらの結果を総合的に分析して、分裂期を通じた微小管構造体の動態制御の分子メカニズムの解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルスの影響により学会等が全てオンラインまたは中止となったため、国内、国際学会に参加するための旅費に主に差額が生じた。次年度に繰り越した金額は、状況が改善された場合の学会参加旅費及び、解析のための消耗品費として使用する。
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