2020 Fiscal Year Research-status Report
Functions of membrane steroid receptors and molecular mechanism of oocyte maturation and ovulation
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20K06719
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
徳元 俊伸 静岡大学, 創造科学技術大学院, 教授 (30273163)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ステロイド膜受容体 / 卵成熟 / 排卵 / ゲノム編集 / スクリーニング法 / 天然活性物質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の第一の目的は細胞膜表面のステロイド膜受容体を介したノンゲノミックなシグナル伝達経路の生理学的意味を示すことである。さらに、これまでのmPRの研究実績を生かして未同定となっているコルチコイドの膜受容体(mGCR)の新規発見も目指す。一方で研究代表者らはサンゴ礁海水中にmPR反応性の天然ホルモン活性物質が存在することを発見し、これを分泌する海藻を特定している。本研究では人工合成に成功（特許技術）しているmPR分子を用いたmPR反応性物質の新規アッセイ法を開発し、この天然ホルモン活性物質の同定を目指す。これまでに新規ステロイド膜受容体mPRの5種類、計7個のmPR 遺伝子のノックアウトゼブラフィッシュ(KO)系統をCRISPR/Cas9システムにより樹立できた。mPR分子を用いたmPR反応性物質の新規アッセイ法についてはグラフェンQドットナノ粒子にmPRを結合させたナノ粒子（mPRα-GQD）を調製し、プロゲステロン特異的な反応性を得ることに成功した。海藻の分泌する天然ホルモン活性物質についても一部の物質についてHPLCによる精製法が確立出来た。
一方、研究代表者らが開発した新規卵成熟・排卵誘導法を用いて選択した排卵誘導遺伝子群についてもゼブラフィッシュKO系統の作出を進めた。これまでに興味深い異常を示す3系統が確認でき、そのうち2遺伝子については論文発表が出来た。転写因子pax2aについては我々のKO系統を用いた解析によりpax2aが卵形成段階で発現し、卵の成長や初期発生に関わることが明らかになった。耳石の正常な形態形成に必要であることが示されていたstarmaker(stm)遺伝子のKO系統では受精膜の機能が不全となり発生率が低下することが明らかになった。その原因として受精膜上のドアノブ状の突起構造の形成異常が起きていることが明らかになった。さらにトリプシン様酵素であるprss59.1のKO系統でも受精膜の形成異常が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新規ステロイド膜受容体mPRの5種類、計7個のmPR 遺伝子のノックアウトゼブラフィッシュ(KO)系統をCRISPR/Cas9システムにより樹立できた。一部の変異系統で発生異常を示すものが得られた。グラフェンQドットナノ粒子にmPRを結合させたナノ粒子（mPRα-GQD）を調製し、プロゲステロン特異的な反応性を得ることに成功した。海藻が分泌する天然ホルモン活性物質についても一部の物質についてHPLCによる精製法が確立出来た。排卵誘導遺伝子候補については興味深い異常を示す3系統が確認でき、そのうち2遺伝子については論文発表が出来た。転写因子pax2aについてはこれまで脳の発生に関する報告はなされていたものの卵や初期卵割段階での機能は不明であった。我々のKO系統を用いた解析によりpax2aが卵形成段階で発現し、卵の成長や初期発生に関わることが明らかになった。耳石の正常な形態形成に必要であることが示されていたstarmaker(stm)遺伝子も排卵時に高発現する遺伝子として我々が同定したが、この遺伝子のKO系統では受精膜の機能が不全となり発生率が低下することが明らかになった（論文発表）。その原因として受精膜上のドアノブ状の突起構造の形成異常が起きていることが明らかになった（論文発表）。さらにトリプシン様酵素であるprss59.1のKO系統でも受精膜の形成異常が確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
系統樹立したmPR KO fish の内、異常を示した系統については異常の原因解明のため、今後、詳細な表現型解析を進める。一方で最初に発見され、生殖機能への関与が示唆されているmPRαとmPRβについては異常は見られなかった。これらの遺伝子には冗長性が見られ、一種類の遺伝子では異常を示さないと考えられる。今後、2重変異体、3重変異体の作出を目指す。mPRα-GQDを用いたmPR反応性物質の新規アッセイ法については論文発表するとともに新規医薬品のスクリーニング法として製薬企業などに広報する。精製法を確立した海藻由来の天然ホルモン活性物質については大量分離による分子の同定を進める。多くの新しい機能の発見が期待される排卵関連遺伝子KO fish系統については残りの8遺伝子についても表現型を注意深く観察し、機能解明を継続して進めていく。
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