パルマ藻を用いて解明するシリカの細胞壁の設計図

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06725
• Research Institution: Fukui Prefectural University
• Principal Investigator: 吉川 伸哉 福井県立大学, 海洋生物資源学部, 教授 (20405070)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 根本 理子 岡山大学, 環境生命科学研究科, 助教 (30625926)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 細胞壁 / バイオミネラリゼーション

Outline of Annual Research Achievements

パルマ藻とケイ藻の共通の特徴は、シリカを主成分とする細胞壁を持つことである。これまでのケイ藻を用いた研究で、シリカの細胞壁の形成に関わるタンパク質は複数発見されているが、ケイ藻では、細胞壁を持たない細胞を人為的に作ることが困難であるため、それらのタンパク質の細胞壁形成時における細胞内での役割は十分に解明されていない。本研究では、ケイ藻とは異なり任意に細胞壁合成を制御することが可能なパルマ藻を用いて、シリカの細胞壁の形成機構を明らかにするため、トランスクリプトーム解析 (RNA-seq解析)・生化学的解析・ゲノム解析により細胞壁形成に関わる遺伝子を同定することを目的とする。ケイ藻のシリカの細胞壁形成では、細胞壁に共存するタンパク質やポリアミンなどの有機基質がシリカ重合に関与することが知られているが、ケイ藻と近縁なパルマ藻においては、シリカの細胞壁に共存するタンパク質は見つかっていない。R3年度は、生化学的な手法により細胞壁形成に関わるタンパク質を探索するため、パルマ藻Triparma laevis longispina細胞からアセトン、SDS処理により細胞壁画分を得た後に、フッ化水素処理によりシリカを溶解し細胞壁に含まれている有機成分を得た。得られた有機成分をSDS-PAGEで分離し、主要なバンドをプロテアーゼ処理後、液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS/MS）に供した。LC-MS/MSで得られたペプチド配列とT. laevis longispinaのゲノム情報から細胞壁に含まれるタンパク質をコードすると予測される２つの遺伝子を同定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ゲノム・系統解析
パルマ藻6種のゲノム解析により、シリカの細胞壁形成に関わる遺伝子として、ケイ藻で報告されているケイ素輸送体(SIT)とケイ素重合(Silicanin)に関わる遺伝子に相同性の高い遺伝子が見つかっている。多くのケイ藻のSITは10回膜貫通型であるのに対して、パルマ藻のSITは20回膜貫通型であった。系統解析の結果、パルマ藻のSITはケイ藻・パルマ藻のSITの系統樹の基部に位置することがしめされた。パルマ藻のSilicaninは、Thalassiosira pseudonanaのものと高い類似性を示し、N末端側にシグナルペプチドと多くのケイ素重合関連タンパク質に保存されているRXLモチーフを持つ点とC末端側の2カ所の膜貫通領域を含む点において、ケイ藻のSilicaninと共通性が見られる一方で、NQを多く含む特徴は見られなかった。Silicaninの系統解析では、パルマ藻のSilicaninは、ケイ藻のシリカニンとは独立したクレードを形成した。
生化学的解析
シリカの細胞壁から抽出されたタンパク質をコードすることが推定された２つの遺伝子（TrLO_g5840, TrLO_g5853）が同定された。ケイ藻のシリカ重合に関わるタンパク質は、シリカ沈着小胞 に輸送されるためのシグナル配列を含むことが報告されており、今回同定された２つのタンパク質は両方ともN末端にシグナル配列を保持していた。また、２つのタンパク質の1次構造に、相同性を示す遺伝子は検出されなかったが、ケイ藻のシリカの細胞壁に共存するタンパク質の特徴であるpentalysine clusterを複数含むことから、新規のシリカ重合タンパク質である可能性が示された。２つの遺伝子がコードするタンパク質の細胞内局在を解析するために、予測されるアミノ酸配列をもとにポリクロナール抗体を作成した。

Strategy for Future Research Activity

R3年度に生化学的手法により見出された、シリカ重合に関わると予測されるTrLO_g5840とTrLO_g5853遺伝子の機能を明らかにするために、発現量解析・細胞内局在解析とin vitroのシリカ重合実験を行う。
パルマ藻がケイ素欠乏下では、細胞壁を作らないまま増殖する特性を利用し、培地中のケイ素濃度を高ケイ素、低ケイ素、ケイ素欠乏条件の3条件下におけるTrLO_g5840とTrLO_g5853について定量PCR法による転写量及び、ウエスタンブロッティング法によるタンパク質量の解析を行う。
前年度に作成した抗体を用いて、間接蛍光抗体法及び免疫電子顕微鏡観察により、TrLO_g5840とTrLO_g5853がコードするタンパク質が細胞壁形成過程のシリカ沈着小胞及び、細胞壁への局在の有無を検討する。
TrLO_g5840とTrLO_g5853を大腸菌に導入し、組換えタンパク質発現系を構築する。生産された組換えタンパク質について、精製を行ったのち、インビトロの実験系を用いてシリカ重合能を解析する。また、得られたシリカについて、その形状を走査型電子顕微鏡で観察し、当該タンパク質の機能を明らかにする。

Causes of Carryover

作成した抗体の精製を次年度に行うこととしため、R3年に予定していた抗体精製用の経費が次年度に持ち越された

Research Products

• [Presentation] The genome biology of parmales Bolidophyceae), a sister group of diatoms (2021)
  • Author(s): Hiroki Ban, Shinya Sato, Shinya Yoshikawa, Kazumasa Yamada, Yoji Nakamura, Mutsuo Ichinomiya, Hisashi Endo, Romain Blanc Mathieu, Akira Kuwata, Hiroyuki Ogata
  • Organizer: Molecular Life of Diatoms 6
  • Int'l Joint Research