2020 Fiscal Year Research-status Report

Morphology and function of fin-ray joints in fish

Research Project

Project/Area Number	20K06727
Research Institution	Jikei University School of Medicine
Principal Investigator	矢野十織東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (10648091)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2025-03-31
Keywords	関節 / ゼブラフィッシュ / 鰭節間関節 / inter-lepidotrichial / joint
Outline of Annual Research Achievements	本研究課題は2020年度～2024年度までの5ヶ年計画において、魚類の鰭条（薄膜状の骨格構造）に存在する骨連結部（joint）を、従来の不動関節（縫合・線維性結合）としてではなく、四肢動物の指節間関節同等の可動関節と定義可能かどうかを分子・形態・機能レベルで検証する。実施初年度である今回、申請時の研究計画調書に基づいて以下（１）～（２）の研究を行った。（１）RNAscope法を用いた高感度in situ hybridization解析のセットアップ可動・不動関節形成因子の1つであるeven-skipped homeobox 1（evx1）遺伝子は、研究代表者・矢野がこれまでに遂行された基盤研究課題内でその重要性を見い出し、本研究課題にて引き続き解析対象としていた。これは遺伝子発現量がごく少量であることに起因しており、evx1エンハンサー活性は関節領域で容易に検出可能であるのに対して、evx1 mRNAの組織内局在を正確に検出できているかどうかは不明であった。RNAscope法はこれを解決する1手法であるため、本年度は解析のセットアップを行った。不動関節である縫合において、従来のin situ hybridization法ではevx1遺伝子の発現を検出できなかったが、RNAscope法を用いることによりこれが検出可能となった。（２）細胞外マトリックス構成因子群・関節疾患関連因子群の遺伝子発現解析申請時の研究計画調書に記したコラーゲン形成遺伝子群（27遺伝子）に対象を絞って遺伝子発現解析を行った。evx1遺伝子のヘテロ・ホモ欠損個体間において、鰭における遺伝子発現を半定量的PCR法ならびにin situ hybridization法によって比較解析したところ、9遺伝子について発現変化が見られた。このうち骨・関節に限局した遺伝子発現を示すものは現在までに確認できなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 上記（１）および（２）の通り計画通りの進捗は一部認められる。また研究計画調書において、（３）FACSを用いたevx1遺伝子発現細胞の単離を2020年度から開始予定であったが、研究室外にある機器を外部業者とともに行う予定であったため、本年度から開始することができなかった。また（４）研究計画調書の設備備品費に計上した関節機能解析装置のセットアップに関しても、外部業者との交流を避けるために、短期間のデモ機器授受に留まった。従って本研究課題の進捗状況はやや遅れていると判断する。
Strategy for Future Research Activity	（１）RNAscope法を用いた高感度in situ hybridization解析のセットアップにおいては、現時点では非特異的と思われる箇所にもシグナルが検出されているため、次年度も引き続きバリデーションを行っていく予定である。（２）細胞外マトリックス構成因子群の発現解析においては、発現量や発現パターンを対象にしていたが、関節形成に特に重要と思われるコラーゲン因子についてはCRISPR/Cas9法によるノックアウト解析を研究計画調書に基づいて行う予定である。（３）FACSを用いたevx1遺伝子発現細胞の単離については、5ヵ年計画前半に着手する必要性があるため、計画通りの予算執行によって2021-2022年度内に行う。また（４）関節機能解析装置のセットアップに関しては、デモ機器においてデータ取得が可能であったため、2021年度前半に購入しセットアップを行う。
Causes of Carryover	研究計画調書で2020年度に行う予定であった（３）FACSを用いたevx1遺伝子発現細胞の単離と、（４）関節機能解析装置のセットアップに係る助成金について、2020年度内に外部業者との綿密な交流をもつことが叶わず、助成金執行することができなかった。（３）については研究機関ならびに研究室内ルールの策定により、2021年度以降は安全対策を遵守した実験の遂行と使用予定通りの助成金執行が可能である。また（４）については既にデモ機器使用により購入目処をつけることができたため、2021年度前半に次年度使用額を執行予定である。