2020 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of amphibian hematopoiesis: the distribution of hematopoietic stem cells in the liver, spleen, and bone marrow.
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20K06729
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
加藤 尚志 早稲田大学, 教育・総合科学学術院, 教授 (80350388)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前野 貢 新潟大学, 自然科学系, 教授 (10190315)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 造血 / 血球 / 両生類 / 造血幹細胞 / 造血因子 / オミクス / アフリカツメガエル / ネッタイツメガエル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血液中を循環する各血球は様々な役割ともち，細胞形態にも違いがあるが，いずれの血球も造血幹／前駆細胞（HSPC）と呼ぶ細胞から分化，増殖して造られる。これが造血である。ヒトの血球産生（造血）は，胎生期に卵黄嚢から始まり，発生が進むと肝臓，脾臓に変わり，出生後に骨髄に移行する。しかし脊椎動物を広く見渡すと，血球を造り出す造血器は動物種毎に異なる。例えば魚類のゼブラフィッシュやメダカの成魚の造血器は，ヒト成人のように骨髄ではなく，腎臓である。本研究対象とするツメガエル（ゼノパス）の成体の造血は，肝臓，脾臓，骨髄の複数の臓器が分担して血球を産生している。
本研究では，ツメガエルのHSPCの特性の解明と分離法を確立し，複数の造血器に存在するＨＳＰＣの性質の違いを明らかにし，次いで，複数の造血器の役割分担を明らかにすることを目指す。
第一年度（本年度）において特に注力した取り組みは，アフリカツメガエル成体の造血器からHSPC候補となる細胞集団が共通して有する分子を目印にして，それらを光学的に検出して分離するフローサイトメトリーによる純化方法の再現性の確認である。目印となる分子の検出方法には，抗体を用いる方法と，抗体を用いることをせずに特殊な蛍光色素の取り込みを利用する方法とがあり，予備的な検討で得られた手法の再現性を複数の実施者間で確認した。また，前者の細胞集団が共通して有する分子を蛋白質レベルで網羅的に検索するにとによって，他の組織細胞と分別するマーカーを見出すことができる。この方法（プロテオミクス）の実験条件について，豊富に採取できるアフリカツメガエル末梢赤血球をモデルにして細胞膜画分について分析法を検討した。その結果，600種の赤血球蛋白質を同定し，このうち細胞膜蛋白質は約200分子が含まれていた。以上，第一年度に予定していた基礎的な実験手法を立ち上げた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ツメガエル成体の造血器からHSPC候補となる細胞集団の純化方法を確立する実験では，主要造血器である肝臓から細胞懸濁液を調製し，フローサイトメーター（FACS Aria III）による分離を実施した。研究代表らが樹立した２種の抗体，すなわちトロンボポエチン（TPO）の受容体MPLを認識する抗体に陽性かつ栓球認識T12抗体に陰性かつ前方散乱光（FSC）が小さい細胞集団（MPL+T12-FSClow 細胞）は，現時点でアフリカツメガエルで実施可能な方法である。また，既に組織幹細胞で報告が蓄積されたヘキスト33342蛍光色素低染色性の「Side Population（SP）細胞」は，特定の細胞膜抗原に依存せず，ＨＳＰＣを含む未分化細胞を分取する方法である。これらの手法は実施者の熟練を要するため，プロトコルの点検と手法の再現性を確認した。本研究では，これらの方法でＨＳＰＣを濃縮，分離した細胞画分の特異的発現分子をＬＣ－ＭＳ－ＭＳによるプロテオーム解析ないしＲＮＡ-Ｓｅｑへ進め，細胞分離に用いる抗体の抗原候補や，各々の造血器由来ＨＳＰＣの特性の違いを探索する。ツメガエルにおける同種の細胞実験例が乏しいため，予備検討として末梢赤血球をモデル細胞とし，細胞膜蛋白質の抽出法を複数実施した。その結果，デオキシコール酸添加・相間移動溶解剤（Phase Transfer Surfactant，PTS）法によって細胞膜蛋白質と考えられる約200分子の同定が可能であった。また，ＲＮＡ-Ｓｅｑを実施するためのインフォマティクス・プラットフォームを整えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は，新型コロナウイルス感染防止のため，実験施設への立ち入りが数カ月にわたって制限されたため，実験動物の飼養，各種実験の実施が停滞してしまった。その結果，第一年度の当初の予定よりも，ＨＳＰＣ候補細胞集団を対象とする発現遺伝子の確認や，in vitroコロニーアッセイによる細胞増殖・分化の面からの解析が遅延した。第二年度にこれらの遅延を取り戻したい。特に，第三年度にかけての展開で必要とする基礎的データとなるMPL+T12-FSClow 細胞あるいはSＰ細胞のプロテオミクスないしRNA-Seqの実施を優先して進める予定である。このため，当実施者の経験が十分ではないRNA-Seqやインフォマティクスでは他研究グループの支援を得る予定である。
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