乾癬遺伝子による毛におけるメラニン色素の周期的な繰り返しパターン形成機構の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06749
• Research Institution: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
• Principal Investigator: 山本 博章 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 客員教授 (40174809)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田村 勝 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, チームリーダー (50370119) ; 矢嶋 伊知朗 芝浦工業大学, システム理工学部, 教授 (80469022)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 毛周期 / 毛色 / 乾癬遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

毛の再生周期等、生命現象の比較的長い周期性を示す分子機構の解明は進んでいない。申請者らは、マウスにおいて、ヒト乾癬の1原因遺伝子であるCARD14遺伝子のオルソログの特異な部位の変異が、数回の毛の生え変わり後から(数回の毛周期を経てのち)、それ以降の毛の再生ごとに毛色を交互に変化させ、1本の毛にも異なるメラニンの繰り返しパターンを発現させることを発見した。申請者らのみが保有維持するこのマウスCard14変異体を用いて、長い周期を持つ毛周期の分子機構に迫る基盤を固めることを目的としたのが本計画である。初年度となる当該年度は、計画遂行に必須となるオリジナルのマウス変異体個体数の回復に努めた。なぜならこのマウス系統は、代表者の山本が、本計画遂行開始前には系統維持に必要な少数の個体数で維持しており、研究遂行に必要な個体数の確保が喫緊の課題となったからである。当該変異体の特徴として、変異表現型が毛色として発現され始めるまでに3か月あまり必要であるため(数回の毛周期を経る必要があるため)、当該年度の前半は当該系統の個体数を増加させることに注力し、計画遂行に必要な変異体数の確保ができたところである。
当該遺伝子産物の発現解析については、抗体を用いた解析を予定し、まずは購入できる抗CARD14抗体について数種類を用いてその有効性の検討を重ねている。このステップは、Card14タンパク質と相互作用する因子の解析にも必須であるため、慎重に検討を重ねている。
またCard14遺伝子産物がメラニン色素合成に及ぼす遺伝子群の発現に及ぼす影響を検出できるマウス変異体を作成する計画については、レポーター遺伝子の制御領域の検討を行いつつあり、異なる遺伝的背景のマウス系統で、黄色のメラニンを合成できるマウス系統との交配も試験的に開始した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

まず実験材料の変異体マウスの個体数を回復させることが必須であったので、これに取り掛かった。その結果、特異な毛色発現を時系列で解析するために必要な個体数を得ることができた(変異アレルを持つ個体においても、毛色変化の強さが弱い個体もあるので、明確な表現型を示す個体を確保するには交配数をある程度大きくする必要があった）。
次に、Card14タンパク質と相互作用する因子の解析に必須となる抗体の選抜については、市販の数種類の製品について詳細な解析を行っている。関連して、当該タンパク質のマウス皮膚における時系列での解析に必要となる組織切片の作成方法について検討が進んだ。固定包埋時の組織のねじれを抑え、作製した切片全長にわたって皮膚表面に対して垂直な切片を取得するためには、技術的な工夫が必要であった。
皮膚メラニン合成細胞であるメラノサイトにおけるメラニン合成の鍵酵素の発現解析を行うためのトランスジェニックマウスについては、高い組織特異性を担保できるプロモーター領域の検討を続けているところである。当該酵素の基質を用いた組織化学によって、毛色の異なる領域の差を示すことができる結果を予備的に得ているため、この手法の妥当性も明らかにする予定である。また、Card14変異アレルを、遺伝学的に黒いメラニンを合成させる遺伝的背景を持つ現在の系統から、黒と黄色のメラニンを合成できるアグチ遺伝子座が野生型の遺伝的背景を持つ系統に導入し、現在2世代目ができたところである。当初の研究実施計画で予定していたように、これらの解析は初年度に開始し、以降も継続することにしていたので、現在の状況はおおむね予想した進捗状況であると判断している。

Strategy for Future Research Activity

毛周期におけるCard14遺伝子の作用機序解明のために、本計画が、当該遺伝子の発現解析を喫緊の課題としていることに変わりはない。初年度に立案した研究実施計画において、初年度に開始した解析項目を２年度以降も継続して行うことを予定していたが、それに変更はない。2年目には何点か判断しなければならない点がある。
１）原因遺伝子Card14の詳細な発現解析については、抗体の選抜が必須であるので、今年度はこれまで試した市販抗体の評価を行い、必要であれば我々自身で設計した抗体の調製を決断する必要がある（山本と矢嶋が協力する）。
２）チロシナーゼを含め、メラニン合成にかかわる遺伝子群の発現をモニターするためのトランスジェニックマウスの作製について、理想的なプロモーターが得られない場合は、ゲノム編集を用いたノックイン手法の検討が必要になる。またチロシナーゼの酵素活性を組織化学的に検出する方法の妥当性もより詳細に検討する必要がある。場合によってはこの手法を、トランスジェニックマウス作製に代わる解析手法として採用できる可能性もある。その際にはこの解析は分担者の田村と山本が協力して行う。
加えて、野生型の毛色を持つマウス系統（アグチ遺伝子座にアグチアレルを持つ系統。1本の毛に黒と黄のメラニン領域を形成できる。しかし、申請者らが維持するCard14変異アレルのように、毛周期を超えて毛色を周期的に変更させることはない）にCard14の変異アレルを導入したマウスの毛色表現型が、予備的な観察ではあるが興味深いので、この解析を進め、これまでの遺伝的背景となっていたノンアグチアレルを持つ系統（黒毛色のみを示す）におけるCard14変異アレルが引き起こす毛色発現パターンと比較解析する（田村と山本が協力する）。メラニン発現の周期性についてより深い理解につながる可能性がある。

Causes of Carryover

新型コロナウィルスによる移動の自粛等で、直接の打ち合わせが困難であったことや、実験補助で予定していた大学院生のアルバイトが予定通り依頼できなかったこと、さらにそれに伴う実験に必要な消耗品の使用が執行できなかったこと等により、未使用分が生じた。次年度（２０２１年度）ではぜひ分担者との直接の討論を重ね、また初年度に予定していた実験（得られた結果を確認するための繰り返し実験）の物品費として執行したい。