2020 Fiscal Year Research-status Report
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20K06762
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
田中 卓 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 主席研究員 (80425686)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | SDR / multi-replicon / RNase H / PriA / RecA / 転写 / G4 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
染色体複製開始において、真核細胞では活性の低い多数の複製起点が活性化するのに対して、バクテリアでは唯一の複製起点が利用される。しかしながら、大腸菌においても安定DNA複製様式（SDR）においては、複数箇所から開始されることが知られており、これが真核細胞のmulti-replicon様式の始祖である可能性を検証するため、SDRの詳細な解析を行った。cSDRはRNaseHI欠損株で恒常的に活性化することから、転写とR-loopの形成が開始に重要であることは予想されてきたが、固有の複製起点とそのメカニズムは明らかになっていない。これまでにter領域に同定した複製起点候補、oriT1は典型的なグアニン四重鎖（G4）形成配列を含むことから、SDR開始は、転写とグアニン四重鎖に制御されるモデルを想定しており、この可能性を検証した。今回は、RNaseHI温度感受性株の樹立により、oriT1の極めて近傍からのDNA合成開始を検出し、 [3H]チミンの直接計数によっても、oriT1を含む領域の欠損株は確かに合成が減弱することを確認した。また、dif配列の欠損は、DNA合成に影響を与えないことから、当初の予想通りdif欠損によるSDR増殖阻害は、DNA合成ではなく、染色体の分離分配の不具合によることが示唆された。SDRに必須のRecA欠損も、弱いながらDNA合成が維持されることから、RecAはSDRにおいて、DNA複製開始以外に機能している可能性が示唆された。RecAはもう一つの必須因子、PriAとin vitroで相互作用するが、ter領域へのRecA結合はPriA非依存であるのに対して、PriA結合はRecAに依存することから、複製開始における機能はRecA依存性に制御される可能性を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
大腸菌の安定DNA複製様式（SDR）が、真核細胞のmulti-replicon様式の始祖である可能性を検証するため、SDRの詳細な解析を行った。同定した複製起点候補、oriT1領域でのDNA合成の正確な位置決定のために行った、RNaseHIの温度感受性株の構築に時間を要した。また、 [3H]チミン取込みによる、SDR活性の解析は、データを収束させるために多くの測定を必要とし、時間がかかった。RecAとPriAの相互作用による活性制御解析では、詳細な滴定を必要としたため遅延の原因となった。ter領域へのPriA結合がRecA依存性であることを見出すためのマイクロアレイ解析にも予定より時間を要した。以上の結果から、oriT1においてRecAとPriAが相互作用し、転写依存性に複製が開始される可能性を見出したが、G4の関与と具体的なメカニズムを直接示す証拠を得ことが達成されておらず、計画がやや遅れていると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
RecAの機能を確定する必要がある。RNA-DNAハイブリッドの形成に働く可能性が示唆されているので、RecA ChIPによるRNAの検出、その時のPriAとの相互作用を解析する予定である。また、転写が複製開始に必要とされることをを、プラスミドの複製系で見出しているが、ここにG4が機能するかどうかは不明なので、これを確かめるため、転写を任意に誘導できる株を樹立した。プラスミドにG4形成配列を挿入し、複製能を解析することで、G4の複製開始に関わる可能性を検証する予定である。さらに、oriT1に含まれるYcjDタンパク質が、G4特異的結合能を持つが、複製開始にどう機能するかを明らかにするため、精製タンパク質による生化学的解析を行う。これらの解析から、転写に伴って形成されるG4によって制御される複製開始機構を確立したいと考えている。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染拡大防止対策として在宅勤務となった期間があったため、実施状況が遅延し、次年度使用へ繰り越された。次年度は、今年度未実施のマイクロアレイ解析を、予定していたNGS解析に合わせて実施する予定である。
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