蛍光を発しないGFPホモログ（色素タンパク質）を利用した神経科学研究ツールの開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06867
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 笠原 和起 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 上級研究員 (50344031)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 色素タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

ハイマツミドリイシ（Acropora millepora；イシサンゴ目）由来色素タンパク質（AmilCP）遺伝子をProof of Conceptとして哺乳類細胞に応用を試みてきたが、色や立体構造やその他の特性について選択と改良を行うため、Actinia equina（イソギンチャク目）、Anemonia majano（イソギンチャク目）、Anemonia sulcata（イソギンチャク目）、Echinopora forskaliana（イシサンゴ目）、Galaxea fascicularis（イシサンゴ目）、Stylophora pistillata（イシサンゴ目）の色素タンパク質遺伝子配列を得た。大腸菌発現ベクターに挿入して大腸菌を用いて発現させた結果、特に色が濃く、アルデヒドや有機溶媒に強い色素タンパク質として、ハイマツミドリイシAmiCP（濃紺色）とヘビイソギンチャクAsuCP（赤色）を選択することができた。この2つの遺伝子に、変異を高頻度で生じるPCRでランダムに変異を導入して改良を行った。また、この2つの遺伝子をランダムに融合させるPCRを行い、改良を行った。それぞれおおよそ20,000クローンずつ作成したが、顕著に優れた変異体を得ることができなかった。
来年度に向けて、AmiCP色素タンパク質をマウス個体へ導入するためのコンストラクト作成を開始した。具体的には、コドンを最適化したAmiCP色素タンパク質遺伝子をマウスゲノムのセーフハーバーサイトにゲノム編集を利用してノックインすることを目指している。Cre/loxPシステムによってCre依存的にAmiCPが高発現するようなコンストラクトを作成している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ランダムに変異を導入する方法で改良を試みたが、残念ながら優れた変異体を得ることができなかった。次年度も時間が許す限り、改良を継続する。

Strategy for Future Research Activity

ランダムに変異を導入する方法で改良を試みたが、残念ながら優れた変異体を得ることができなかった。色素タンパク質遺伝子を導入した変異マウスの作製に並行して、色素タンパク質の改良も継続する。

Causes of Carryover

今年度は大腸菌を用いた色素タンパク質遺伝子の改良であったため、時間と手間はかかるが試薬等の支出は少なかったが、次年度は、マウス個体に色素タンパク質遺伝子を導入する研究を行うため、胚操作実験や飼育に使用する予定である。