2020 Fiscal Year Research-status Report
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20K06870
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
塚田 祐基 名古屋大学, 理学研究科, 助教 (80580000)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 神経回路 / シナプス / 配線 / レーザー手術 / 光遺伝学 / 光操作技術 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、神経回路に対して光を用いたマイクロ-ナノメートル単位の時空間操作を行い、その影響を神経活動と個体行動の計測として定量することで、神経回路の構造が回路全体の機能においてもつ役割の理解を進めることを目的とする。この目的達成のため、本年度は主に以下の項目について進捗があった。異所局在の解消、インテグラントの作成、蛍光3色イメージングの実現、パルスを用いた光毒性の軽減、AIY介在神 経細胞の応答ばらつき解消。まず異所局在の解消については、光遺伝学によるシナプスレベルの神経活動制御に対してminiSOGを用いた方法を進めているが、miniSOGを標的神経細胞へ発現させる際、シナプスへの局在と共に、細胞体のERらしき場所にも発現する問題があった。そのためER移行シグナルを付加させたタンパク質を新たに作成し、標的神経細胞のプロモーターと共に導入したところ、この異所局在が解消された。これにより光によるERへの不必要なダメージが低減されることが期待できる。これらのタンパク質を発現した線虫系統は、染色体外に導入遺伝子を保持するものであったため、ゲノムに挿入させたインテグラント系統の作成することで、遺伝子発現の安定化と系統のばらつき抑制を実現した。さらにこれまでGCaMPとRCaMPで神経活動を計測していた線虫系統に、633nmの長波長で励起される蛍光タンパクを導入し、シナプスをラベルした。この3色イメージングにより、シナプス位置を計測しながらレーザー手術を行うことが実現できた。また、連続光ではなくパルス光を使うことによる光毒性の低減、さらには実験操作の工夫により、ばらつきの多かったAIY介在神経細胞の応答を均一化することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では特に、光を用いて単一シナプスの解像度で神経回路の配線操作を行い、その影響を計測する手法を確立し、シナプスの位置や数、種類によって構成される神経回路の構造が神経情報伝達にどのように寄与するかに注目している。シナプスレベルでの操作の実現と、検証したいことを調べられる実験系の構築を進めることができ、順調に実験方法が確立されつつあるため、概ね順調に進展している、を選択した。
単一シナプスの解像度で実験を行う際に気をつける必要があるのは、光で操作したときの影響が本当にシナプスに対してであるかどうかで、他の部位への影響は極力排除する必要がある。そのため、概要に記述した異所局在の排除や、インテグラントの作成による安定した遺伝子導入系統の作成は実験を進める上で役に立つだけでなく、結果の解析や解釈においても間違いや混乱を防ぐものとなる。さらに、技術的に難しい蛍光3色イメージングを達成したことで、近接する二つの神経細胞からの同時活動計測と共に、シナプスの位置も同じ個体を観察することで同定することが可能になった。特にレーザー手術において、シナプスの位置を把握しながら切断箇所を決めることが可能になったため、実験の可能性や、解釈できる範囲が拡大した。また、光抑制に用いる光照射パターンについても、強度やパルスの形状、頻度など様々なパラメータを設定する必要があるが、個体へのダメージを抑えるパルス光を用いることで、内在的な神経活動への影響を抑えながら光遺伝学的な操作を実現できることが確認できた。光遺伝学における光照射自体の生体への影響は、シナプスレベルで行う緻密な実験において非常に重要な要素であり、検証したいAIY介在神経細胞の活動への光照射自体の影響を計測しながら、それを抑えた実験方法を確立することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに作成したminiSOGの異所局在を抑えたインテグラントや、三色蛍光イメージングが行える遺伝子導入系統を用いることで、研究目的に掲げている、神経回路に対して光を用いたマイクロ-ナノメートル単位の時空間操作を行い、その影響を神経活動と個体行動の計測として定量する実験を進める。
まずは、作成したインテグラントのバックグラウンドにある遺伝子変異を排除するため、野生型とバッククロスを何回か行い、実験に適した系統を確立する。そして、このバッククロスした系統を用いて、個々のシナプスを光照射により抑制した個体について、温度刺激を与えながら神経活動を計測する。 光により活性酸素を生成するminiSOGは温度受容神経細胞AFDのプレシナプスに局在しているため、シナプスへの操作により下流の介在神経細胞であるAIYでの活動に影響が出ると考えられ、カルシウムイメージングによりその検証を行う。一方、3色イメージングができる系統を用いて、シナプスの位置を把握した上でフェムトセカンドレーザーを用いた神経繊維の切断手術を行い、任意のシナプスのみ接続している状態での神経活動の計測と行動の計測を行う。これらの実験で得られたデータを解析するために、神経活動伝達についての数理モデルを構築することで、仮説の検証を進める。特にシナプスの位置に依存して、神経活動の伝達における特異性があるかどうか、また、シナプスの数によって神経活動の伝達に変化があるかどうかを検証し、神経回路構築における根本原理となるような知見を探索する。シナプスへの操作と、実験から得られる計測値はばらつきを含むことが予想されるため、ばらつきを極力抑えるように実験計画を検討し、またその統計的な扱いを熟慮する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルスの影響により、出張のキャンセル、禁止等で旅費の使用に変更が生じたこと、また大学の閉鎖、自粛処置による実験計画の変更、さらに医療関連物品の入手困難による物品の欠如に伴った実験計画の変更により予算の使用額に変更が生じた。
市場の混乱も収まりつつあり、物品購入の計画や、旅費使用の計画に修正をすることで、次年度の使用計画を再度検討する。
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Research Products
(4 results)
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[Book] デジタル細胞生物学2021
Author(s)
三浦 耕太、塚田 祐基
Total Pages
212
Publisher
メディカル・サイエンス・インターナショナル
ISBN
978-4-8157-3012-3
