2021 Fiscal Year Research-status Report
Mechanism of G protein signals regulating bi-directional axon transport and axon growth, regeneration and degeneration
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20K06880
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
中村 岳史 東京理科大学, 研究推進機構生命医科学研究所, 教授 (60362604)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞内シグナル伝達 / 軸索伸長 / 軸索再生 / 小胞輸送 / G蛋白質 / イメージング / 軸索変性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類成体の中枢神経軸索は損傷からの再生能力を失っている。私たちは、これまでに、膜輸送の制御を通じて神経突起の伸展を促進するGタンパク質TC10が末梢神経の軸索再生及び人工的に誘導された中枢神経の軸索再生に不可欠であることをノックアウトマウスの解析により示した。また、TC10が膜輸送の制御だけでなく、微小管を安定化させて軸索の退縮を防ぐことによって神経突起伸展を促進していることを見出した。本年度は活性型TC10から微小管安定化までのシグナル経路を明らかにすることを目的として解析を進めた。それにより、細胞膜と小胞の２か所に存在するTC10のうち、小胞上のTC10が微小管の安定化に働いていること、その経路には微小管制御因子であるSCG10とMAP1Bのリン酸化が存在することを示すことができた。SCG10にもMAP1BにもJNKによるリン酸化部位が存在するが、TC10 KOマウスの神経細胞ではJNKのリン酸化レベルの低下が認められたことから、活性型TC10>JNK活性化>SCG10およびMAP1Bのリン酸化>微小管安定化というモデルを考えている。
変性蛋白質の細胞内蓄積に由来する神経変性疾患の初期病変の多くについて、リソソームの形成と細胞内配置の異常が関わると考えられている。Rab7 Gタンパク質はリソソーム分解経路のマスターレギュレーターであることから、アルツハイマー病モデルを使って、Rab7活性を可視化するセンサーにより変性疾患とリンクするRab7活性分布の異常を検索する研究を進めている。脳スライス等での検討を想定してAAVによりRab7センサーを神経特異的に発現させる系を構築済みであり、さらに、プロモーターとAAVのセロタイプを検討することで、共焦点顕微鏡によるFRETイメージングでの解析を行うのに十分な蛍光強度を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ノックアウトマウスの解析により、神経突起の伸展を促進するGタンパク質TC10が末梢神経及び中枢神経の軸索再生に不可欠であることを示した。また、TC10が膜輸送の制御だけでなく、微小管を安定化させて軸索の退縮を防ぐことによって神経突起伸展を促進していることを見出した。TC10欠損による退縮頻度の増加やアセチル化チューブリン（安定な微小管のマーカー）レベルの低下は野生型TC10の発現によってレスキューできたが、細胞膜に局在するTC10変異体（TC10 KRasCT）ではレスキューできなかった。小胞上のTC10活性が細胞膜のTC10活性よりも高いという以前の結果を考え合わせると、微小管の安定化には小胞上のTC10が働いていると考えられる。その経路には微小管制御因子であるSCG10とMAP1Bのリン酸化が位置する。SCG10にもMAP1BにもJNKリン酸化部位が存在する。TC10 KOマウスの神経系ではJNKのリン酸化レベルの低下が認められたことから、、活性型TC10>>JNK活性化>SCG10およびMAP1Bのリン酸化>微小管安定化というモデルを考えている。
後期エンドソームやリソソームで構成される分解経路は細胞内輸送の主要ルートである。変性蛋白質の細胞内蓄積に由来する神経変性疾患の初期病変の多くについて、リソソームの形成と細胞内配置の異常が関わると考えられている。本研究課題は、アルツハイマー病の複数のモデルを使って、分解経路のマスターレギュレーターであるRab7の活性を可視化して、神経変性疾患とリンクするRab7活性分布の異常を検索する。脳スライス等での検討を想定してAAVによりRab7センサーを神経特異的に発現させる系を構築した。海馬初代培養神経細胞へのAAV感染による条件検討では、ヒトシナプシンIプロモーターとセロタイプ2/2の組み合わせで最も良い結果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの解析で、TC10による軸索伸長促進に働く新たな経路として「小胞上の活性型TC10>>JNK活性化>>SCG10およびMAP1Bのリン酸化>>微小管安定化」というモデルを提案している。そのモデルのさらに深い検証と生理的な意義の解明を行うために、主に以下の３点について解析を進める。1) このシグナル経路においてTC10に直接結合するエフェクターとして働く分子は何か、2) このシグナル経路が微小管近傍で局所的に働いていることを実験的に示せるか、3) TC10から発する微小管安定化・軸索伸長促進というこのシグナル経路が、TC10による軸索再生の促進に働いていることを示せるか。3)については、TC10ノックアウトマウスにおける中枢神経（視神経）再生能の低下が、この経路に位置する分子をAAVウイルスを用いて異所性に発現させることでレスキューできるかどうかを調べることで検討することを予定している。
本年度までの研究で、ヒトシナプシンIプロモーターとセロタイプ2/2の組み合わせでRab7センサーを組み込んだAAVを使うことで、神経細胞特異的にRab7活性のFRETイメージングを行える条件を見出した。次年度は、海馬初代培養神経細胞でのRab7活性の空間分布を共焦点顕微鏡により検討して生理的な状態での標準的な活性分布を把握する。次に、アルツハイマー病モデルとしてbCTFの強制発現により病理的なtraffic jamを誘導する系での検討を行い、病理的な状態では、生理的的な活性分布からどのようなずれが生じるかを検討することを計画している。
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| Causes of Carryover |
支出はほぼ予定どおりに進めており、11,678円の次年度使用額は翌年度分とあわせて主に消耗品の費用として使用する。
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Research Products
(6 results)
