Identification of core cells for sleep-wake by functional connectome analysis

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06885
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 松本 桂彦 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (60632859)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 3次元イメージング / 組織透明化

Outline of Annual Research Achievements

マウス全脳での蛍光シグナルの3次元的な定量には、できるだけ等方的なイメージングを行う必要がある。そこで、光シート顕微鏡のｚ分解能の悪さ（従来10um程度）をAxial-sweep法を導入することで改善を行った（3~4 um)。これにより、マウス脳を膨張さて実質的に解像度を向上させるCUBIC-X手法を用いずにマウス全脳の全細胞解析が可能となり、c-Fosに定量的な解析が可能な顕微鏡の基盤技術を確立した。Axial-sweep法の光シートの焦点位置の走査には、液体レンズ（ETL)を用いたが、付属の制御ドライバや外部の電流制御装置では、20fpsでの走査が限界であった。そこで、液体レンズ表面を高速かつ振動を抑制するレンズドライバを作製し、使用しているsCMOSカメラ(浜ホト社製：Orca-flash）)の最大フレームレート(30msサイクル,各ピクセル5ms露光）まで高速化することに成功した。
また、睡眠時、覚醒時または薬剤刺激などでどの神経細胞の活性が向上するのかを同定するため、マウス脳の透明化およびc-Fos抗体によるマウス全脳染色条件の検討を行い、最適な抗体の種類と染色条件を決定した。
さらに、新規の導入した長作動距離対物レンズ（NA0.3, WD32.9)を有した光シート顕微鏡を作製し、大きな臓器まで観察可能な大型光シート顕微鏡の作製を行い、マウス脳だけでなく、ラットやマーモセット全脳まで研究対象を拡張できるようになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

顕微鏡の構築、3次元染色など技術面は順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

R2年度に作製した顕微鏡とサンプルのイメージングとデータ解析を実施する。マウス全脳のすべての細胞のc-Fos発現状況の定量化と時系列による変化を網羅的に解析する。より詳細な解析が必要になる可能性があるため、神経の細胞の種類を特定するための免疫染色条件の探索をする必要になるかもしれない。そのため、上記データ解析と平衡し、各種神経細胞マーカーのマウス全脳免疫染色の条件検討を実施する予定である。

Causes of Carryover

予定していた顕微鏡関連部品や消耗品の一部が、コロナの影響で年度末までに入手できず、次年度発注となったため次年度に発注を行い、当初予定している研究を進める。