軸索発達促進因子25型コラーゲンの分子基盤と先天性脳神経支配異常症の病態機序

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06888
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 若林 朋子 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任准教授 (20530330)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: コラーゲン / 運動ニューロン / 神経筋接合部 / 神経発生

Outline of Annual Research Achievements

Collagen XX（ColXXV）は発生期の骨格筋に発現する膜貫通型のコラーゲンであり、運動ニューロンの軸索伸長に必須の役割を果たす。本研究ではColXXVの神経軸索伸長の制御因子としての生理機能に着目し、分子基盤の解明を目指す。
令和3年度には、ColXXVの “骨格筋由来の軸索発達促進因子”としての役割を実証する目的で、筋特異的にColXXVを発現誘導する遺伝子改変マウスを作出した。CRISPR-Cas9システムを用い、Cre依存的にColXXVを発現するloxP-stop-loxP-COL25A1ベクターの、Rosa26領域へのノックインを行った。計82匹の産仔のうち目的領域への組換えが生じた個体は得られず、F0としてトランスジェニックマウスを8匹得た。これより作出したF1個体と、骨格筋の形成初期から筋細胞にCreを発現するHSA-Creマウスとの交配を行い、複数のF2個体を得た。
ColXXVの軸索・骨格筋再生における機能に関連して、成体骨格筋におけるColXXVの機能を解析するため、NMJ形成後の骨格筋でCol25a1を欠損し、致死性をレスキューしたマウスを作出した（MCK-Cre;Col25a1flox）。これらのマウスは発生異常を示さず、成体を得た。
またColXXVの軸索・骨格筋再生における機能について、神経細胞側の結合因子RPTPσ/δとの相互作用が軸索伸長を促進する機序を検討する。RPTPσ/δは細胞膜上でのクラスタリングにより活性が制御されることから、膜上での会合状態を評価する実験系を構築した。ひとつにはNanoBiTシステムを用いた発光レポーターを応用し、Small-BitおよびLarge-Bitを融合したRPTPσの発現系を、またEGFRの細胞内領域とPTPRσの細胞外領域を融合したキメラ受容体PTPRσTKを用いた実験系を構築した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

新型コロナウイルス感染の拡大に伴う緊急事態宣言の発出により、令和2年度に動物実験にかかる活動の制限が生じ、計画に遅延が生じたが、令和3年度にはこれらの活動制限も概ね解除され、計画に沿って研究を遂行している。

Strategy for Future Research Activity

ColXXVの “骨格筋由来の軸索発達促進因子”としての役割の実証について、令和4年度には確立したCre誘導性ColXXVトランスジェニックマウスについて、既に得られつつある骨格筋特異的Cre発現マウス（HSA-Cre）との交配による産仔あるいは胎児を用いて解析する。発生期の骨格筋における持続的なColXXV発現が運動ニューロン発生に及ぼす影響について、横隔膜を始めとする骨格筋における運動ニューロンの軸索の支配過程を、発生期を追って解析する。
ColXXVの軸索・骨格筋再生における機能に関連して、令和3年度に得られた成体骨格筋特異的ColXXV欠損マウス（MCK-Cre;Col25a1flox）に対し、軸索障害あるいは筋障害を誘導し、神経筋システムの再生過程へのColXXVの欠損の影響について解析を行う。
またColXXVの軸索・骨格筋再生における機能について、構築したRPTPσ/δの細胞膜上での会合状態を評価する実験系を用い、ColXXVとの結合がRPTPσ/δの細胞内動態に及ぼす影響を、培養細胞の実験系を用いて明らかにする。