2021 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of neural circuit formation by Olig2 in the forebrain
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20K06895
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
小野 勝彦 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30152523)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
後藤 仁志 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20462202)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 前交連 / L1-CAM / 蛍光抗体法 / Olig2 / 軸索ガイダンス分子 / 回路形成異常 / 正中交差 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
転写因子Olig2は、マイクロアレイ解析から、axon-guidance pathwayの遺伝子群で発現変化がみられることが明らかとなった。このことから、前交連は、視床前端部／視交叉レベルの前脳で左右交差する神経回路である。多くの遺伝子欠損マウスで、形成不全が報告されていることから、Olig2欠損マウスでもこの神経回路の形成を調べた。前交連の線維はイムノグロブリンスーパーファミリーに属するL1－CAMを発現しており、まずこれを指標として調べた。
先行研究から、マウス胎仔の前交連は、胎齢14～15日目（E14～E15）に左右交差する回路が形成されることが明らかにされていることから、この時期から解析の対象とした。安楽死させた妊娠母獣から胎仔を取り出し、パラフォルムアルデヒド液にて固定し、これを振動歯ミクロトームで80μm厚の切片を作製し、抗L1-CAM抗体で蛍光抗体法で染色し、観察した。
E14.5の野生型マウスの前脳では、約半数のマウスで左右交差回路が形成されていた。さらにE15.5およびこれ以降になると解析したすべての例で左右交差回路の形成がみられた。一方、Olig2欠損マウスではE14.5およびE15.5では、L1-CAM陽性の神経束が正中線方向に伸びている像は見られるが、左右交差は見られなかった。E17.5までには、左右の脳室層が密着している領域で少数のL1-CAM陽性線維で正中線を越えているものがあった。しかし、同腹の野生型もしくはヘテロ接合マウスの前交連と比べると、明らかに交差する線維は少なく、背腹レベルも異常であった。したがって、Olig2の欠損により、前交連の形成に異常（遅延）がみられることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Olig2欠損マウス胎仔の形態解析で、パラフィン切片やDiIトレースから前交連形成異常が示唆されてきたが、L1-CAMという特異的（選択的マーカー）を用いて、経時的に明らかにすることができた。この結果から、胎齢後期の回路以上形成に先立って、交差回路形成の遅れがあることが示された。
その原因の一つの可能性として、また、Olig2欠損マウスの新たな表現型として、左右の脳室層の融合の遅延と脳室の拡大が見出された。これまで、遺伝子欠損マウスでみられる神経回路形成の異常は、多くの場合、軸索ガイダンス分子の発現異常によるものと考えられてきた。新たな表現型からは、水頭症の可能性、脳室層融合不全の可能性などが予想される。特に、脳室層の融合については、最近の研究から神経上皮の融合には、上皮間葉転換（epithelial to mesenchymal transition; EMT）にかかわる遺伝子群の関与が指摘されている。したがって、Olig2が転写調節因子であることから、Olig2の下流因子として、EMT関連遺伝子群が存在する可能性が出てきた。したがって、Olig2の研究に新たな展開の可能性が出てきたと言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
Olig2欠損マウスと野生型マウスの胎仔の前脳の切片を解析している過程で、前交連線維の交叉の遅れとこれに続く回路形成異常があることが明らかになった。軸索の正中交差が適正に行われるためには、適正な時期に左右の脳室層が融合する必要がある。Olig2欠損マウスでは、前交連線維は、正中方向に伸びているものの、そのレベルでの脳室層の融合がみられず、このために線維の交叉不全がみられることが予想された。また、これに伴い、この時期の第三脳室前端部の拡大が示唆されている。現在、あらたな切片を作製して、脳室の広さを比較している。水頭症／脳室層の融合形成不全についての解析であり、新たな表現型としてみなすことができるかどうかを明らかにする。
上述の通り、神経上皮の融合には上皮間葉転換（epithelial to mesenchymal transition; EMT）にかかわる遺伝子群が関与する可能性があることから、既報のOlgi2欠損マウスのマイクロアレイ・データベースからこれらの遺伝子を拾い出し、発現変化の様式を明らかにする（in silico解析）。その後、遺伝子発現変化の有無を、定量PCRにより解析を進める。野生型およちOlig2欠損マウスの脳を用いて、前交連が形成されるE13.5～E14.5の時期の全RNAを抽出し、逆転写反応によりcDNAを作製、これを鋳型として、マイクロアレイ・データベースから拾い出した遺伝子の発現変化を調べる。これによりOlig2により前交連形成を調節している責任遺伝子の候補をさらに絞っていく。
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| Causes of Carryover |
抗体の発注と納品とが年度をまたぐことから、発注を控えた。その間に、連携研究者から同一抗体を受領して試しに使ったところ、全く目的にかなわないことがわかった。このため、残額は最終年度の予算と合わせて、本研究にかかわる別の試薬を購入するために使用する。
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Research Products
(3 results)
