2020 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of novel mGluR1 function in the neonatal hippocampus
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20K06932
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
武藤 恵 関西医科大学, 医学部, 講師 (50298189)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 代謝型グルタミン酸受容体 / 海馬 / カハールレチウス細胞 / 細胞内カルシウム動員 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)にはそれぞれ機能と組織局在が異なるサブタイプが存在し、その特異的作動薬・阻害剤は、脳疾患の治療薬や治療法の開発に役立つとして注目されている。mGluR1はｍGluRのサブタイプの一つで細胞内Ca2+濃度上昇を介して種々の生理学的反応を惹起し、また神経細胞興奮調節やシナプス可塑性に関わる。幼若期の海馬ではカハール・レチウス細胞（CR細胞）に集中して発現するが、その機能にはいまだ不明な点が多い。これまでの研究で幼弱海馬のCR細胞がmGluR1を介して著しいCa2+動員を示すことを初めて明らかにしたが、本研究では幼弱海馬CR細胞のmGluR1について、他の受容体とのクロストーク、細胞の興奮性や海馬神経ネットワークに与える影響などを多面的に検討し、未知の機能の解明につなげる。
2020年度はmGluR1を介する細胞内ストアからの放出以外のCa2+濃度上昇経路と他受容体・チャネルの修飾について実験を行った。mGluR1刺激後のCa2+濃度上昇はTRPチャネルのブロックによっては抑えられなかった。細胞外からの流入による成分は僅かで、一般にCa2＋チャネルを作動させている可能性は低いと考えられた。またmGluR1とGABA受容体がCR細胞上で相互作用する可能性を検討したが、幼弱小脳プルキンエ細胞等で報告されている相互増強作用は認められなかった。以上の研究成果をまとめ、学会で発表した。
さらにCR細胞においてCa2+動員を引きおこすかどうかがこれまで明らかでなかった、または機能発現そのものが示されていなかった受容体について、受容体刺激による細胞内Ca2+濃度上昇を観測した。イオンチャネル型グルタミン酸受容体とmGluR1受容体との相互作用については解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CR細胞におけるmGluR1を介する細胞内Ca2+動員の経路と他チャネル・受容体との相互作用について、2020年度に予定していた実験をほぼ行うことができた。
幼若ラットの海馬から作成した急性スライス標品を用い、蛍光色素を使用したイメージングの結果を記録した。mGluR1受容体特異的アゴニストを投与し、340 nm / 380 nm蛍光強度比によって表されるfura2負荷細胞内カルシウム濃度の変化を指標としてmGluR1受容体の機能を観測した。Ca2+流入経路の検討のためにチャネルをブロックした状態での実験を行い、ブロックなしの場合の結果と比較した。他受容体との相互作用の検討のためには、それぞれの特異的アゴニスト・アンタゴニストを組み合わせて投与し、単独刺激による反応との差異を求めた。途中、それまで使用してきたマイクロスライサーの使用に制限がかかったので、将来スライス標品作成が不可能になる可能性を考慮し、代替としての単離細胞作製の予備実験を行った。実験に適した単離細胞の調製にまでは至らなかったが、その後マイクロスライサーの使用が継続できたので、スライス標品を用いる予定していた実験を続行した。
mGluR1刺激後のCa2+濃度上昇に占める細胞外からのCa2+流入が小さかったので、今後は主としてCa2＋チャネル以外のチャネルあるいは受容体との相互作用について研究を進めていくが、そのための予備実験として、これまでに発現が報告されていない受容体のCR細胞での機能的発現を確かめた。また2021年度以降の電気生理学的研究に備えて、購入したマニュピュレータ―をセットアップし、必要な実験系を整えた。研究環境に関して、非常事態宣言時に動物飼育の抑制依頼があったが、実験の時期の調整等で対応できた。現在までの成果について学会で発表し、また論文を執筆中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内Ca2+動員の経路について、mGluR1刺激時の反応ではCa2+流入による成分が少なく細胞内ストアからのCa2+放出による部分が大きいと分かったため、どのストアから放出されるかなどCa2+放出の機序に重点を移して機能解明を行う。他受容体等と共同した機能発現については、これまでの実験結果から、ともに幼若期の細胞に発現していてもCR細胞におけるmGluR1の役割は小脳プルキンエ細胞等におけるmGluR1の役割とは同じでないと考えられる。従って対象範囲を広げ、幼弱期に限らずこれまで他組織や再構成系でmGluR1の機能発現への関与が示唆されているそのほかの受容体・チャネルや、これまで関与の報告のない受容体・チャネルとの相互作用の可能性を検討する。また、もし再びマイクロスライサーの使用制限の問題が生じた場合は、別のマイクロスライサー使用の可能性を探るとともに、2020年度の予備実験に引き続き単離細胞の調整を試みる。
予定しているmGluR1受容体刺激時の電流・電圧変化についてのパッチクランプ実験を開始する。CR細胞から電位固定法により膜電流変化を記録する。mGluR1活性化時の電流変化を計測し、その電位依存性や各種阻害薬に対する感受性を調べ、mGluR1の機能を推定する。また電流固定法によりmGluR1受容体刺激後の膜電位を測定し、細胞興奮性への関与の有無を明らかにする。また、CR細胞上のmGluR1の活性化が海馬神経ネットワークへ及ぼす影響を検討する。この場合、CR細胞から錐体細胞への入力は興奮性であるので、周囲のGABA作動性（抑制性）介在ニューロンを経由した間接的な影響をGABA受容体の特異的阻害薬で抑制した状態でCR細胞をアゴニストで刺激し、錐体細胞から電流を記録しそれを解析する。
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| Causes of Carryover |
旅費の残額については、参加した学会がコロナ禍によりWeb開催となったので、予定していた学会旅費が不要となった。消耗品費の残額については、ほぼ申請書の内容で購入したが、交付決定額に合わせて全体数を縮小する際に予算を超えない金額に収めて端数を残した。
2020年度は交付決定額に合わせて計画から実験量を少し減らしたので、旅費残額を含めた繰越を消耗品費として追加実験に使い、例数を増やす予定である。2021年度の予算は本来の2021年度に計画していたものに使用する。
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Research Products
(1 results)
