Development of a versatile design method for protease inhibitors based on hydroxyproline

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06953
• Research Institution: Kyoto Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 小林 数也 京都薬科大学, 薬学部, 准教授 (80647868)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: プロテアーゼ阻害剤 / ヒドロキシプロリン / BACE1 / SARS 3CLプロテアーゼ

Outline of Annual Research Achievements

汎用的プロテアーゼ阻害剤設計戦略の確立を目標として、ヒドロキシプロリンを基盤としたβ-セクレターゼ（BACE1）及びSARS 3CLプロテアーゼ（3CLpro）阻害剤の構造活性相関研究を展開した。
（１）BACE1阻害剤の構造活性相関研究では、ビフェニルアミノカルボニル基の末端芳香環上の置換基について検討を行った。これまでの検討において、パラ位へのメチル基の導入が活性の向上に寄与することが示されていたため、パラ位への各種置換基の導入を検討した。イソプロピル基、メトキシ基、シアノ基、フルオロ基、トリフルオロメチル基を導入したところ、メトキシ基では無置換体と比較して同程度の活性が維持されていたが、その他の置換基では阻害活性の大幅な減弱が確認された。これらの結果から、ビフェニルアミノカルボニル基の末端芳香環パラ位に許容される置換基は限定的であり、またこの芳香環の相互作用が活性発現に極めて重要であることが示唆された。
（２）SARS 3CLpro阻害剤の開発研究では、昨年度から引き続きヒドロキシプロリンの水酸基へのジフェニルメチル（DPM）基の導入反応について検討を行った。種々ルイス酸触媒について検討した結果、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛(II)を用いた際に、最も良い収率で目的物を得られることを見出した。続いて、本法を用いてwarheadとしてアクリロイル基または2-ブチノイル基を有する誘導体の合成を行った。阻害活性評価については初期検討しか行えていないものの、いずれの誘導体も弱いながらも阻害活性を示す（IC50 = 10~100 μM）ことを見出し、ヒドロキシプロリン構造がSARS 3CLpro阻害剤の新規骨格として機能しうることを明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

（１）BACE1阻害剤の構造活性相関研究では、活性の向上は認められなかったが、これまで十分に検討を行えていなかったビフェニルアミノカルボニル基の末端芳香環への置換基の導入と活性評価を実施し、パラ位置換基に関する構造活性相関を得ることができた。検証が必要な部分構造の合成法はおおむね検討が完了しているため、これまでの知見に基づく更なる構造活性相関研究も問題なく実施できると考えている。
（２）SARS 3CLpro阻害剤の開発研究では、ヒドロキシプロリン水酸基のDPM化反応の反応条件を最適化し、誘導体合成を実施できる状況を確立できた。また、合成した誘導体において弱いながらも明らかなSARS 3CLpro阻害活性を確認することができ、新規阻害剤骨格としてのヒドロキシプロリンの有用性を明らかにすることができた。
以上の点から、本年度の研究はおおむね順調に進展したと判断した。

Strategy for Future Research Activity

（１）BACE1阻害剤の構造活性相関研究では、ビフェニルアミノカルボニル基の末端芳香環のメタ位への置換基の導入を検討する。対象の芳香環はドッキングシミュレーションの結果から、S1’ポケットに収容されていると推定している。一方研究代表者は、過去のペプチド性BACE1阻害剤の開発研究において、P1’位への酸性官能基の導入が活性の向上に寄与しうることを報告している。そこでこれらの知見に基づき、対象の芳香環のメタ位に酸性官能基を中心とした各種置換基の導入を行い、高活性誘導体の創出を目指す。100 μM以下のIC50値を示す化合物については、BACE1との共結晶を作成し、X線結晶構造解析を行うことで結合構造を同定する。得られたデータを基に新たな分子設計を行うことで、研究の効率化を図る。
（２）SARS 3CLpro阻害剤の開発研究では、合成した誘導体の阻害活性評価を実施し、正確な阻害能を算出するとともに、更なる誘導体合成を展開する。①warheadの構造、②エーテル置換基の構造、③アミド置換基の構造、の3点について順次最適構造の探索を行う。また、本年度合成した誘導体も含めて100 μM以下のIC50値を示す化合物については、（１）と同様にプロテアーゼとの共結晶を作成し、X線結晶構造解析を試み、分子設計の効率化を図る。

Causes of Carryover

（理由）
昨年度の研究はおおむね順調に遂行することができたが、一昨年度に実施できなかった内容からのスタートであったため、申請段階で想定していた内容を全て実施するには及ばなかった。特にSARS 3CLプロテアーゼ阻害剤の開発研究においては、誘導体合成を展開する段階まで研究は進展したが、活性評価試験を本格的に実施する段階までは研究を進めることができず、それらに関する支出が抑えられた。上記の理由から、次年度使用額が生じた。
（使用計画）
次年度使用額は、当初の予定通り誘導体合成と活性評価に関する費用として使用する。翌年度分として請求した経費は、得られた高活性誘導体の構造解析、及びその情報をもとにした更なる誘導体合成と活性評価のための費用として使用する。当初予定から使用用途について大きな変更はない。