2020 Fiscal Year Research-status Report
細胞膜タンパク質の天然構造を用いた構造エピトープ同定法
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20K06959
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Research Institution | National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition |
Principal Investigator |
伊勢 知子 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 創薬デザイン研究センター, プロジェクト研究員 (20771900)
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Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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Keywords | 抗体 / エピトープ / 競合結合阻害 / フローサイトメトリー / 膜抗原 |
Outline of Annual Research Achievements |
抗体の機能は、その抗体が結合する抗原の部位(エピトープ)に大きく依存している。この機能的エピトープの同定には、抗体の抗原結合を競合阻害するグループ分類が、最も確度が高い方法と考えられている。しかし、競合阻害には、一般に、改変した可溶性の膜抗原が代替抗原として用いられ、生体膜上で発現している膜抗原の天然高次構造を、従来の競合阻害法に用いることは、技術的に困難であった。 本研究は、生体膜上に発現した膜抗原の本来の天然構造を用いて、未精製、無標識抗体の逐次結合アッセイを開発し、簡便かつ膜抗原に普遍的に応用できる新しい機能エピトープ同定法を確立することを目的としている。具体的には、我々が既に抗体パネルを取得している細胞膜タンパク質のひとつであるTNFレセプター2(TNFR2)をモデル抗原とし、下記2つのAimの達成を目指す。Aim1:天然膜抗原を細胞膜に存在する状態で用いて、抗体の競合結合阻害に基づいた蛍光ビーズフローサイトメトリーによるエピトープマッピング法を確立する。Aim2:高次構造が保持されやすいドメインキメラ変異体をデザインし、さらにオルソログを含め、それらを用いたエピトープ位置のマッピングを行い、Aim1で確立した方法の有用性を比較、検証する。 令和2年度は、Aim1について、まず、抗体の競合阻害を検出するのに最適のサイズと蛍光色素を持ったビーズを選定するために、異なるメーカーが市販する各種蛍光ビーズを、抗マウスポリクローナル抗体でコンジュゲートし、抗TNFR2抗体をコートした蛍光ビーズの作製に成功、さらに、これらの蛍光ビーズの抗原発現細胞への結合をフローサイトメトリーにおいて検出することにも成功した。Aim2については10種類のドメインキメラ変異体をデザインし、作製中である。また、5種類のオルソログの発現プラスミドの作製に成功した。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Aim1については、異なるメーカーが市販する各種蛍光ビーズを、抗マウスポリクローナル抗体でコンジュゲートし、抗TNFR2抗体をコートした蛍光ビーズの作製に成功し、さらに、これらの蛍光ビーズの抗原発現細胞への結合をフローサイトメトリーにおいて検出することにも成功した。しかしながら、競合阻害を高感度で検出するには、結合の検出効率をさらに上げることと、細胞に対する蛍光ビーズの非特異的結合を減らす必要があり、これらは今後の検討課題となった。 Aim2については10種類のドメインキメラ変異体をデザインし、作製中である。また、5種類のオルソログの発現プラスミドの作製に成功している。今後は、完成したオルソログを始め、ドメインキメラ変異体の完成したものから順に抗体の反応性をフローサイトメトリーで調べ、エピトープ解析を行う。
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Strategy for Future Research Activity |
Aim1については、今後は、引き続き、フローサイトメトリーでの抗体の競合阻害を検出するために、細胞上に発現させた抗原と各抗体の結合の検出効率を上げることと、細胞に対する蛍光ビーズの非特異的結合を減らす条件検討を行う。検出効率を上げるには、より蛍光強度の高い蛍光色素を用いることや、発現レベルの高い細胞を使う等の方策により改善を検討していく。また、データ解析において、抗原特異的結合を非特異的結合と区別できるような方法を取り入れることで、実験系の改善に通じると考えられるので、その点を追求していく。 Aim2については順調に進展しているので、現在の方針を引き続き進めていく。
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Causes of Carryover |
(理由)令和2年度に計画していた実験が一部次年度にずれ込んだため。 (使用計画)次年度の物品費として使用する。
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