2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of enhanced throughput LC/MS assays of steroid hormones based on sample and analyte-multiplexing
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20K06990
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
東 達也 東京理科大学, 薬学部薬学科, 教授 (90272963)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石毛 崇之 千葉大学, 医学部附属病院, 臨床検査技師 (30757315)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 検体・項目多重化 / ハイスループット / 原発性アルドステロン症 / 加齢男性性腺低下症候群 / LC/MS / 臨床検査 / 誘導体化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2020年度に超選択的副腎静脈採血法（ssAVS）と検体・項目多重化（SAM）-LC/MS/MS技術を組み合わせた，原発性アルドステロン症（PA)の新規ハイスループット検査手法を開発したが，本年度はその臨床応用を検討した．すなわち，片側性PAと診断された患者6人から得られたssAVS試料を分析し，血清アルドステロン（ALD）濃度が異常高値を示す試料を特定し，それらの採取部位がALD産生腫瘍（APA）部位と一致することを示した．さらに両側性の特発性アルドステロン症（IHA）の2検体でもその診断を確定させるデータが得られた．このように開発した方法がPAの病型（片側性または両側性）や病変部位の特定に有用であることが実証できた．また，ssAVS試料の24検体の分析において，分析にかかる時間が従来法の約40%に短縮できることを示し，目的の分析ハイスループット化を達成した．これらの成果を学術誌に発表した．
また，本年度は加齢男性性腺低下症候群（LOH症候群）の第一診断指標である血清テストステロン (TST) と診断確度を向上させるデヒドロエピアンドロステロンサルフェート (DHEAS) の同時・4検体一括測定法を開発した．上記のPAの研究に用いたGirard試薬の中から，DHEASをESI(+)モードで高感度に応答させ，TSTとの同時測定に適した4種を選抜した．除タンパクのみの簡便な前処理で精度，正確度に優れ，血清マトリクスの影響を受けない定量法を確立した．40検体を分析するとき，前処理以降にかかる時間が40％に短縮された．このように，2種の物性の異なるアンドロゲンに対し，血清4検体の一括測定を可能にした．これらの成果も学術誌に発表した．
さらに，中鎖アシルCoA脱水素酵素 (MCAD) 欠損症のマーカーである尿中ヘキサノイルグリシンの3検体一括定量法も確立した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上述のように，まず，前年度に開発したssAVS試料中ALDの6検体一括定量法の臨床実用性を評価し，極めて良好な結果が得られた．すなわち，片側性PAと診断されたAPA患者6人，両側性PAのIHA患2人のssAVS試料を分析し，血清ALD濃度が異常高値を示す部位を確実に特定できた．したがって，開発した方法により治療方針，つまり，病変副腎の全摘除，部分摘除（正常部位の温存術）あるいは薬物療法の決定が可能であることが強く示唆された．さらに24検体の測定において，従来のLC/MS/MS法の約40%の時間で結果が得られることが証明され，本研究課題の第一の目的であるハイスループット化が達成できた．
次に血清中TSTとDHEASの4検体一括定量法を開発し，各種バリデーション試験ならびに実用性の評価試験を終えることができた．この研究では，当初6検体一括定量を目指したが，装置の性能の問題から，4検体一括へと下方修正せざるを得なかった．しかし，SAM技術のための適切な試薬の選択，物理化学的性質及び血中濃度差の大きいTSTとDHEASの同時定量のための前処理法，LC及びESI-MS/MS条件の最適化などを経て，十分な性能を有する方法を確立した．肝心のハイスループット化は，40検体測定において，分析時間は従来法と比べて40％であり，満足な成績が得られた．
上記の2つの研究成果を学術論文として発表した．このように，2021年度当初の計画に沿って実験を進め，概ね目的の成果が得られた．
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| Strategy for Future Research Activity |
女性の骨粗鬆症のSAM-LC/MS/MS検査法：エストラジオール（E2）及び25-ヒドロキシビタミンD3（25(OH)D3）用MSタグセット及びそれを用いた定量法の開発と実用性評価を遂行する．2021年度に数種のCookson型試薬とE2の反応を検討したところ，既報及び期待に反し，良好な結果が得られなかった．すなわち，検討したCookson型試薬は25(OH)D3には有効であるが，いずれもE2と十分に反応しないか，反応しても複数の生成物を与え，その誘導体化には不適であった．そこで他の試薬を検討する．E2に対して反応性及びその誘導体のESI-MS/MS応答性が優れた試薬を選抜し，そのアイソトポログを合成する．この際，当初の目的である25(OH)D3との同時誘導体化は困難となる可能性が高い．そこで，E2は上記の新しい試薬で，25(OH)D3は既存のCookson型試薬のDAPTAD及びそのアイソトポログで誘導体化する新規方法を確立する．次いで，血清又は血漿を用いた実用性評価を行う．
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