2021 Fiscal Year Research-status Report

Mesurement of nucleic acid medicine in biomaterials by enzymatic amplification methods

Research Project

Project/Area Number	20K06991
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	張替直輝日本大学, 薬学部, 教授 (90454743)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	核酸医薬品 / 遺伝子増幅法
Outline of Annual Research Achievements	前年度は、遺伝子増幅法であるLigase Detection Reaction(LDR)を用いて、FomivirsenとNusinersenの2つの核酸医薬品の検出法を検討し、共に1～100 nMの濃度で定量的に検出できた。本年度、このFomivirsenの検出法を学術学会で発表した。しかし、これらの検出法では、複数の大きさの増幅産物が生じるという問題点があり、リガーゼ反応でできた環状DNAを定量PCRで測定することが要因と考えられた。そこで本年度、その問題を解決し、感度や精度の改善を試みた。まず、環状DNAを酵素反応で直鎖にした後、定量PCRで検出を行ったところ、単一の増幅産物が得られた。更に定量PCRによる検出をSYBR Greenから加水分解プローブに変更し、特異性を高めた。これらの改良により、Fomivirsenの検出法では40倍、Nusinersenの検出法では10倍程度、感度が改善した。また、血清からの核酸医薬品の抽出法として、アルカリ性の試薬を用いた簡易核酸抽出キットで検討したところ、LDRで増幅曲線が認められ、血清濃度3.13～1600 nMのFomivirsenを定量的に検出できた。このFomivirsenの検出法については、学術学会での発表と学術論文への投稿の準備を進めている。更に、LDRを中心に検討する一方で、それ以外の遺伝子増幅法による核酸医薬品の検出法としてdUプローブを用いた方法も開発し、現在、学術論文に投稿中である。この方法はDNA polymeraseが作用する核酸医薬品であること、核酸医薬品の配列中にアデニンが含まれていることなどの条件はあるが、Fomivirsenを0.1～100 nMの範囲で定量的に検出できた。また、生体試料からの核酸医薬品の測定についての総説を執筆し、核酸医薬品の遺伝子増幅法を利用した検出法について情報発信も行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 前年度、遺伝子増幅法としてLDRを用いた核酸医薬品の検出法を開発したが、生体試料中の核酸医薬品を定量するためには感度などの改善が必要であった。そこで今年度は、この感度の低下の要因として考えられるLDRの非特異的な増幅産物の影響を無くすため、リガーゼ反応で生成した環状DNAを酵素反応で直鎖にした後、定量PCRによる検出を行った。更にその定量PCRによる検出をSYBR Greenから加水分解プローブに変更し、特異性を高めた。その結果、Fomivirsenの検出法では40倍、Nusinersenの検出法では10倍程度、感度が改善した。そして当初から計画していた今年度の課題である生体試料からの核酸医薬品の抽出として、核酸医薬品とハイブリダイズするDNAやRNAのプローブを固定した磁気ビーズを用いる方法、シリカ膜やイオン交換樹脂のカラムを用いる方法を検討した。しかし、それらでは十分な回収率は得られなかった。そこで、アルカリ性の試薬を用いた簡易核酸抽出キットを検討した。その血清抽出試料をLDRしたところ増幅曲線が認められ、Fomivirsenを血清濃度3.13～1600 nMの範囲で定量的に検出することができた。しかし、前年度で生じた遅れを完全に取り戻すことができず、当初の計画で今年度に予定していた血清中のNusinersenの検出法の開発を行うことができなかった。現在、Fomivirsenでの抽出法を応用し、血清中のNusinersenの検出法の開発を進めている。
Strategy for Future Research Activity	今年度は、前年度開発した遺伝子増幅法による核酸医薬品の検出法を改良し、ヒト由来DNAが共存する試料からでも高感度にFomivirsenとNusinersenを検出する方法を開発することができた。更に、簡易核酸抽出キットで血清を処理することで、血清からFomivirsenを定量的に検出することもできた。そこで、次年度は血清中のFomivirsenの検出法を応用し、血清中のNusinersenの検出法を開発する。そして、実際にマウスへNusinersenを投与して血液や尿などの生体試料を回収し、それらの中に含まれるNusinersenを開発した方法で測定する。当初の計画ではこの実験にラットを使用する予定であったが、動物や核酸医薬品の費用がかかるため変更する。また、簡易核酸抽出キットでは血清以外の生体試料に対応できない可能性があることや、試料が希釈されるため感度が低下することから、引き続きシリカ膜やイオン交換樹脂などのカラム、核酸医薬品を回収するDNAやRNAのプローブを固定した磁気ビーズなどを用いる核酸医薬品の抽出法についても検討する。それらの検討が予定よりも早く終了した場合は、Fomivirsen のようなS化DNAやNusinersen のような2'-MOE化されたRNAとは異なる、モルフォリノ核酸を導入したViltolarsen、2'-Fluoro化や2'-O-Methyl化されたRNAのGivosiranなどの検出法の開発に取りかかりたいと考えている。
Causes of Carryover	前年度、新型コロナウイルス流行により緊急事態宣言が発令され、それに伴い大学において研究室での卒業研究が原則禁止となったこと、宣言が解除された後も研究室内の人数が制限されて研究協力者の学部学生の協力が当初予定していた半分程度しか得られなかったことなどで研究が遅れ、前年度の予算の一部を今年度に繰り越した。この繰り越した予算と今年度の予算を使い、この遅れを挽回すべく研究を進め、1-2年目に計画していた内容の8割程度は達成できた。血清中のNusinersenの検出法が残っているが、血清中のFomivirsenの検出法を応用し、開発したいと考えている。そのため、今年度の未使用分の予算を核酸の簡易抽出キット、リガーゼやポリメラーゼなどの酵素、検出用のプローブ合成に充て、血清中のNusinersenの検出法の開発を行う。