2021 Fiscal Year Research-status Report
高機能化マイクロチップ電気泳動システムによる糖鎖、リン酸化の全自動解析
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20K06993
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
山本 佐知雄 近畿大学, 薬学部, 講師 (10707954)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | マイクロチップ電気泳動 / リン酸化ペプチド / Phos-tag / アクリルアミドゲル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高機能化マイクロチップ電気泳動システムによる糖鎖、リン酸化の全自動解析では、ガンなどの疾病によりタンパク質のリン酸化や糖鎖付加などの翻訳後修飾がどのタイミングでどのように変化するのかを解明する分析手段の開発について検討を行っている。目的とする分析法を開発するためには前処理を含む一連の分析操作を一枚のチップ上で電圧印加のみで達成できる条件の開発が必要となるが、特にターゲットとしている糖鎖やリン酸化などの翻訳後修飾はタンパク質重量から換算すると数%以下であることが多いため、本法を開発するためにはオンラインでの高感度検出に係る前処理を高効率に達成することが必要不可欠になる。
本年度はリン酸化ペプチドのオンライン高感度検出に向けてリン酸化化合物を特異的に捕捉することが可能なPhos-tagを含有したアクリルアミドゲルを多分岐のマイクロチップの流路にピンポイントで作製することによりリン酸化ペプチドの特異的濃縮、オンライン標識、分離・検出を電圧印加のみで達成できるシステムの検討を行った。タンパク質にトリプシン消化を実施することにより得られたペプチドを試料として、まずは試料溶液をマイクロチップの流路交差部の一つに作製したPhos-tagアクリルアミドに導入した。この操作によりリン酸化ペプチドのみをPhos-tagゲルに捕捉し、膨大な単純ペプチドを除去することが可能となった。続いて電圧を切り替えてゲルに向かって蛍光試薬を導入することによりゲル中での蛍光標識化を達成した。最後に高濃度のリン酸緩衝液をゲルに向かって導入することでリン酸化化合物を高感度に検出することが可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和3年度はリン酸化ペプチドのオンライン高感度検出に向けてリン酸化化合物を特異的に捕捉することが可能なPhos-tagを含有したアクリルアミドゲルを多分岐のマイクロチップの流路にピンポイントで作製することによりリン酸化ペプチドの特異的濃縮、オンライン標識、分離・検出を電圧印加のみで達成できるシステムを開発した。
本来ならば、このオンライン標識法を糖ペプチドにも応用し、糖ペプチドとペリン酸化プチドを同時に検出できるシステムを作製する予定であったが、新型コロナウイルス感染症対策のため、十分な実験を行うことが出来ず、予定よりもやや遅れた結果となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度は前年度の研究結果を組み合わせて以下の検討を行う。まずはタンパク質のトリプシン消化物を試料溶液として糖鎖付加とリン酸化修飾を同時に検出できるシステムの開発を目指す。このシステムが開発出来たのち、昨年度に開発したサイズ排除用のマイクロチップを用いることで細胞から総タンパク質を抽出するシステムとの組み合わせを実施する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症対策に伴い消耗品等の消費が少なくなったことと、参加予定であった学会のほとんどがオンライン開催となったため。
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Research Products
(7 results)
