統合的構造解析で解明するLAIRの機能発現メカニズム

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06999
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 吉田 卓也 大阪大学, 薬学研究科, 准教授 (00294116)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: LAIR / NMR / X線結晶構造解析 / MDシミュレーション

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor（LAIR）ファミリーが担うコラーゲン依存的な免疫抑制メカニズムの構造基盤を明らかにすることを目的としている。そのためNMR/結晶構造解析/MDシミュレーションを統合的に活用して、LAIRの特異な動的構造が担うコラーゲン認識メカニズムと、免疫抑制シグナルの発信に重要な、コラーゲンを介したLAIR分子同士の相互作用の詳細解明に取り組んでいる。本年度は、LAIR/コラーゲンモデルペプチド複合体の立体構造解析に向けて、hLAIR-2コラーゲン結合ドメイン(LAIR2-CBD)と結合するコラーゲンモデル配列候補との共結晶化を試みた。その結果、数種の結晶を得たが、現在までに複合体を含有するものは得られず、コラーゲンモデルペプチドのみが結晶化していた。一方、NMRによる相互作用解析ではLAIR2-CBDのコラーゲン認識残基を確認できたため、複合体モデルの構築を試みた。LAIR2-CBDのMDトラジェクトリから、100個の構造を抽出し、化学シフト摂動の情報を用いてhLAIR-2-CBD/コラーゲンモデルペプチド複合体の試行アンサンブルを作成した。ここからhLAIR-2-CBD－コラーゲンモデルペプチド間での原子間の衝突が少ない配座を選び、それぞれエネルギー最小化を行った後、最も低いエネルギーを示したものを複合体のモデル構造とした。構築した複合体モデル構造に共通して、hLAIR-2-CBD中の可動性の高いループ領域がコラーゲンの三重らせん構造を包み込むような構造をとることで、接触面積を増やし結合を安定化させていることが推測された。また、この構造を基にしたSteered MDによる解離シミュレーションについて検討した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

NMRによる相互作用解析の結果に基づき、hLAIR-2-CBDとコラーゲンモデルペプチドとの共結晶化を試みたが、適切な結晶を得ることができなかった。一般にコラーゲンはその三重らせん形成により1方向に延びた棒状構造をとり、また対称性により結合部位に多重性が生じるため、構造決定に適した複合体を調製することは容易でない。そのため時間をかけた条件検討が必要であるが、今年度はCOVID-19により十分な検討時間の確保に問題があった。

Strategy for Future Research Activity

今年度の結果を受けて、NMRおよびMDによる検討を進め、より適したコラーゲンモデルペプチドを設計する必要がある。また、その共結晶化については引き続き取り組んでいく。さらに、コラーゲン分子に対し複数のLAIR分子が結合する様子を捉えるため、当初の予定通り分子内に常磁性タグを導入したLAIRを用い、コラーゲン上でのLAIR分子の相 対配置をNMRの常磁性緩和を利用して解析する。

Causes of Carryover

今年度、測定用試料となるペプチドを購入する予定であったが、実験に適切な配列の決定に至らなかったため購入が遅延した。今年度前半には配列を改めて設計し、ペプチドを購入する予定である。