2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of a fully automated online simultaneous analysis method of steroid hormones and its application to metabolomics
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20K07007
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| Research Institution | Shujitsu University |
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Principal Investigator |
片岡 洋行 就実大学, 薬学部, 教授 (80127555)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ステロイドホルモン / 硫酸抱合体 / メタボロミクス / バイオマーカー / オンライン自動分析 / 固相マイクロ抽出法 / LC-MS/MS分析 / 唾液 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和2年度は、9種のステロイドホルモン類及び代謝物である4種のステロイドホルモン硫酸抱合体をそれぞれ一斉分析するために、インチューブ固相マイクロ抽出(SPME)／LC－MS/MS法による高感度なオンライン自動分析システムを考案開発した。
1. プレグネノロン(PRG)、プロゲステロン、コルチゾール(CRT)、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、テストステロン、エストロン、エストラジオール(E2)及びエストリオールを分析対象として、インチューブSPME条件を最適化した結果、検討した抽出キャピラリーの中でSupel-Q PLOTが最もよく、試料40 μLを0.2 mL/minの速度で25回繰返し吸入／吐出する時、効率よく抽出できた。いずれの化合物もDiscovery HS F5カラムで8分以内に一斉に分離分析でき、ESI-ポジティブモードMRM検出により数十pgの検出限界が得られた。また、安定同位体希釈法により0.1～10 ng/mLの範囲で良好な直線性と再現性を示し、尿及び唾液試料も直接または限外ろ過するだけで分析できた。
2. PRG、CRT、DHEA及びE2の硫酸抱合体を分析対象として、インチューブインチューブSPME／LC－MS/MS分析条件を検討した結果、抽出キャピラリーとしてPRGS はSupel-Q PLOT、CRTSはCarboxen 1006 PLOTが最もよく、DHEASとE2Sはいずれのキャピラリーでもよく、pH 3で25回繰返し吸入／吐出する時、効率よく抽出できた。いずれの化合物もInertSustain C18 HPカラムで4分以内に一斉に分離分析でき、ESIネガティブモードMRM検出によりpgレベルの感度を示し、安定同位体希釈法により0.1～100 ng/mLの範囲で直線性、再現性とも良好で、唾液試料も限外ろ過するだけで分析できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ステロイドホルモン類とそれらの代謝物のインチューブSPME／LC-MS/MS分析システムの構築は概ね達成できたが、当初予定していたプリカーサーイオンスキャンによる未知代謝物マーカーの検索、乳幼児からの尿・唾液採取を容易にするための乾燥ろ紙サンプリング法については検討できていない。コロナ禍の中で、標準試薬の海外からの調達や施設の利用が難しく、学生協力者の支援が得られず実験の進行が遅れ、またLC-MS/MS装置の故障で約1ヵ月以上使用できなかったことも原因である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ステロイドホルモン類とそれらの代謝物をインチューブSPME／LC-MS/MS法により、簡便迅速に高感度分析できることがわかったので、今後は化合物の種類を増やすとともにステロイドホルモンと代謝物をポジティブ／ネガティブの切り替えで一斉に分析できるよう分離を検討して、ステロイド代謝変化を網羅的に解析するためのプロファイルを作成する予定である。また、検討できなかったプリカーサーイオンスキャンによる未知代謝物マーカーの検索、乾燥ろ紙サンプリング法についても検討する。さらに、ステロイドホルモン類の生体レベルの変化から、ストレスやヒーリングへの影響を解析するとともに、合成ステロイド剤や食品中のステロイド関連化合物がステロイド代謝に与える影響を網羅的に解析していきたい。
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| Causes of Carryover |
ステロイドホルモン類の標準品が海外にしかなく輸入に時間がかかったことと、LC-MS/MS装置が一定期間故障して修理までに時間を要したことにより、予定していた実験ができず次年度に繰り越す必要が生じたため。次年度予算と合わせて、計画的に使用する予定である。
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Research Products
(14 results)
