超耐熱化蛋白質融合抗体フラグメントの創製

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07008
• Research Institution: Sojo University
• Principal Investigator: 大栗 誉敏 崇城大学, 薬学部, 教授 (70346807)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安楽 誠 崇城大学, 薬学部, 教授 (60398245)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 抗体エンジニアリング / Pichia pastoris / アダリムマブ / タンパク質の安定化

Outline of Annual Research Achievements

抗体エンジニアリングの発展により、多くの抗体フラグメントが開発されている。Fv領域は抗原結合を担う必須のドメインであるが、単独では安定性に問題がある。そこで本研究では、熱安定性の高いタンパク質をFvへ融合させ、安定性の高い抗体フラグメントを作製することを目的としている。抗体として、これまで酵母より大量発現に成功している抗体医薬品アダリムマブのFv領域をターゲットとした。また植物由来のホモ二量体であるphlp7へ分子間SS結合を導入した変異体(M5C)を安定性の高い土台のタンパク質とした。
これまで遺伝子操作によるFv融合体の発現系の構築を行い、酵母より大量発現させ、目的の二量体タンパク質を調製できたが、融合しているphlp7の分子間SS結合の形成が見られなかった。そこで2022年度においては、引き続きFvとphlp7をつなぐリンカーを検討した。リンカーをGGGGGGSとした融合体、またFvのC末端アミノ酸の長さを変えた融合体など、計10個の融合体を作製し、酵母より生産し調べた結果、分子間SS結合形成は見られなかった。また調製した融合体について、フォールディングによる試験管内でのSS結合形成実験を行った。種々の条件検討の結果、昨年度検討GS融合体同様、一部で分子間SS結合形成が見られたものの、ほとんどが分子間SS結合を形成させられなかった。phlp7変異体は２箇所で分子間SS結合を形成するよう設計しているが、１箇所のみの変異体を作製し、分子間SS結合形成を調べたが、この変異体においても分子間SS結合形成が見られなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2022年度は、遺伝子操作により10種のFv融合体の酵母発現系を構築し、大量培養を行った。目的のVHとVL融合体形成が確認出来ているが、これらの変異体についてもphlp7の分子間SS結合形成がみられていない。

Strategy for Future Research Activity

Fv融合体の土台となるphlp7の分子間SS結合を形成させることを次年度の最優先課題と位置づける。引き続き、リンカーアミノ酸の種類、長さ、リンカー接合部位を変えた変異体を作製して検討する。一方で、宿主として新たに大腸菌を使い、フォールディングによる調製を試みる。

Causes of Carryover

新型コロナ感染症の影響もあり、実験が予定より遅延しているため