2023 Fiscal Year Research-status Report
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20K07008
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| Research Institution | Sojo University |
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Principal Investigator |
大栗 誉敏 崇城大学, 薬学部, 教授 (70346807)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安楽 誠 崇城大学, 薬学部, 教授 (60398245)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 抗体エンジニアリング / Pichia pastoris / アダリムマブ / タンパク質の安定化 / 融合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗体エンジニアリングの発展により、多くの抗体フラグメントが開発されている。Fv領域は抗原結合を担う必須のドメインであるが、単独では安定性に問題がある。そこで本研究では、熱安定性の高いタンパク質をFvへ融合させ、安定性の高い抗体フラグメントを作製することを目的としている。これまでに抗体医薬品アダリムマブのFv領域に、安定性が著しく上昇した二量体phlp7の分子間SS結合導入変異体を融合させた分子の発現系を構築し、酵母による調製を行ってきた。その結果、VHとVLからなる二量体タンパク質の調製に成功した。しかし融合しているphlp7の分子間SS結合の形成は確認出来ていなかった。2022年度はFvとphlp7をつなぐリンカーやFvのC末端アミノ酸の長さを変えた融合体など計10個の融合体を作製し、酵母より生産し調べたが、分子間SS結合形成は見られなかった。Phlp7はドメインスワッピングによる二量体構造を形成しており、単量体構造も形成することが報告されている。そこで2023年度では、phlp7の分子間SS結合が形成されないのは、phlp7が単量体構造を形成している事を考え、単量体形成を抑制する変異体の作製をおこない、単量体構造に必要なターン構造を抑制するためターン構造の出現頻度の低いVal残基の導入を試みた。これまで作製した数種の変異体のターン領域へVal-Val配列（G33V+S34V）を変異導入した結果、一部で分子間SS結合によるphlp7の二量体形成が初めて確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2023年度は、これまで作製した変異体の数種に対し、phlp7の単量体形成を抑制し、二量体形成を促すVal-Val配列の変異を導入した結果、一部ではあるが、初めてphlp7部位の分子間SS結合による二量体形成が確認されたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
Fv融合体の土台となるphlp7の分子間SS結合を形成させることが課題であったが、phlp7の単量体形成を抑制し、二量体形成を促すVal-Val配列の変異導入が有効であることを見出した。引き続き、リンカーアミノ酸の種類、長さ、リンカー接合部位を検討しつつ、Val-Val配列の変異を導入し、目的の融合タンパク質の作製を試みる。作製に成功した融合体については、熱安定性、結合活性を詳細に解析する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ感染症の影響が響き、実験が予定より遅延しているため。
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Research Products
(2 results)
