2020 Fiscal Year Research-status Report
小胞輸送障害の定量的・網羅的解析法の確立によるアルツハイマー病治療薬の探索
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20K07014
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
高杉 展正 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (60436590)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
橋本 唯史 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任准教授 (30334337)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | アルツハイマー病 / リピッドフリッパーゼ / アミロイドβ / 小胞輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、アルツハイマー病（AD）初期において、輸送小胞の肥大化を伴う小胞輸送障害が起こり神経機能を障害することが明らかにされている。しかし、その分子機構は不明であり、さらに定量評価可能な測定系がない。そのため小胞輸送障害を標的とした治療薬の開発は困難であった。そこで我々は早期AD予防・治療薬の開発を目指し、小胞輸送の評価系の構築、分子機構の解析を行っている。
本年度は孤発性ADに深く関与するβセクレターゼ（BACE1）を恒常発現するADモデル細胞系を樹立し、生化学的手法を用い解析した。BACE1の酵素活性増加によりAD関連タンパク質の一つAPPの代謝物、C-terminal product of β-secretase cleavage（βCTF）が増加し、脂質輸送タンパク質の一つであるリピッドフリッパーゼのコンポーネントの一つであるTMEM30Aと結合することを見出した。
リピッドフリッパーゼは輸送小胞の形状形成を制御し、小胞輸送に必須な因子であったことから、βCTF結合による酵素機能への影響に注目し、輸送小胞におけるリピッドフリッパーゼの活性を測定する新しい評価系の樹立を目指した。その結果、split-luciferaseを利用した新規測定系を構築し、リピッドフリッパーゼの活性評価に成功した。さらに、輸送障害を改善しうる候補分子を同定し、その処理により、リピッドフリッパーゼ・輸送小胞の機能が改善されることから、リピッドフリッパーゼはADにおける新規治療標的となることを明らかにした。
現在、ADモデルマウスにおいて、βCTFによるリピッドフリッパーゼの機能低下が小胞輸送に及ぼす影響について解析している。今後は新規測定系の妥当性評価を進めていき応用範囲を広めるとともに、AD治療候補化合物の効果検討をしていくことで根本治療薬の開発に貢献することが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はコロナウイルス蔓延の影響も有り、一時研究中止を余儀なくされ、学会参加も制限されていたが、論文執筆の準備をする等研究をすすめるべく努力した。
後期からの予想以上の進捗も有り、当初の目的であった小胞輸送障害の測定系の開発、リピッドフリッパーゼの間接的な活性評価系の構築、AD治療薬として開発されているBACE1阻害薬の小胞輸送障害改善作用、TMEM30AとβCTFの結合を阻害するペプチドの同定とその治療標的としての有用性の確認など、当初の目標を概ね達成できている。これらの成果はこれまでに評価系のなかった小胞輸送障害研究に有用なツールを提供し、小胞輸送障害が関わる筋萎縮性側索硬化症など、AD以外の神経変性疾患研究にも応用可能であると自負している。また治療標的ペプチドを用いて、βCTFとTMEM30Aの結合を評価できる簡便なスクリーニング系の構築にも成功しており、本系は標的ペプチドと同様の性質、すなわちβCTFとTMEM30Aの結合を阻害する化合物の同定に有用であると考えている。
また東京大学医学部 橋本 唯史准教授より、βCTFの蓄積期間が長くADの初期病態を反映しているADモデル、A7マウスを提供いただき解析を進めた。その結果、βCTFとTMEM30Aの結合がADモデルマウス脳で特異的に観察されることが明らかになった。さらに加齢依存的にリピッドフリッパーゼ複合体の形成が低下し、活性も低下することを明らかにした。
本研究結果はリピッドフリッパーゼ活性低下とAD病態形成の関連を強く示唆しており、小胞輸送障害の改善を目指した新しい治療標的を提示するものである。ほぼ研究計画通りに進行しており、概ね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
動物モデルを用いた評価をさらに進めていき、成果をまとめ次年度中に学術誌に発表することを目指している。本成果の発表により、ADにおける小胞輸送障害メカニズムとその治療標的の提示し、分野の創薬研究の進歩に寄与できると考えている。
また、βCTFにビオチン結合酵素BirAを融合し、バイオラベリングの利用によりβCTFに結合する因子を更に網羅的に探索し、小胞輸送障害の原因因子、影響を受ける輸送基質などを明らかにしていき、AD病態との関わりをさらに解析していく予定としている。βCTFは蓄積すると細胞外に分泌される性質を持つことから、本検討により早期ADの診断マーカーを同定することも期待している。
さらに標的ペプチドを用い、バイオアベイラビリティや膜透過性の改善ができるか検討し、ADモデルマウスに投与、または発現させるなどの検討によりAD治療薬としての可能性を検討していく。βCTF部分にはADなどの疾患の変異部位が多数あり、本モデル系の利用により、リピッドフリッパーゼ活性に影響のある変異があるか解析していく。またペプチドと同様の化合物が存在するか、化合物スクリーニングを行う予定としている。二次的なスクリーニング系として応用するためAD患者や、βCTFを多く産生しAD発症危険性が高いことが知られているダウン症患者由来のiPS細胞をもちいた小胞輸送障害評価系を開発していく。本研究は順天堂大学 櫻井 隆教授との共同研究で行う予定である
構築したモデル系が実際の小胞輸送の効率解析に使用できるか、細胞内小器官を移動するタンパク質の輸送評価などを行い妥当性評価と効率の向上に務める。特に、アデノ随伴ウイルスを用いた応用範囲を広めた小胞輸送測定系の構築を行い、初代培養、海馬切片培養上の神経細胞を用いた解析を確立していく。
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