2021 Fiscal Year Research-status Report
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20K07029
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
小川 英知 大阪大学, 生命機能研究科, 特任准教授(常勤) (20370132)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | オートファジー / 遺伝子導入 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞は細胞外からの様々な異物侵入を検知し、それらを排除するために選択的オートファジー機構を使用する。この選択的オートファジー機構は、外来異物だけでなく核酸の導入に対しても同様に働くため、特に基礎研究や医療の場では, 核酸導入が必要な場面で大きな障害となる。我々はオートファジーレセプターp62に着目し、p62の欠損が著しい核酸導入効率の促進を示すこと、その原因が細胞質に侵入した核酸周辺のUb化をp62の欠損が著しく遅延をおこすためであることを突き止めている。これらを踏まえ、低分子化合物を用いてp62の機能を阻害することで、効果的な遺伝子導入促進剤の開発を試みた。低分子化合物ライブラリーを用いたハイスループットスクリーニングを行うために、遺伝子導入効率を定量化が可能なルシフェラーゼアッセイの実験系を構築し、様々な条件検討を行いプロトコールの確立を行った。この実験系を用いて既知物質の低分子化合物ライブラリーをスクリーニングしたところ、約4000化合物から100種類弱の明らかな促進作用を示す化合物を得ることができた。その中から再現性のある高い活性をもつ９つの化合物を選定し、p62KO MEF細胞を用いてその化合物のp62依存性を調べたところ、何れの化合物も活性促進がみられず、これらの化合物がp62依存性を示すことが明らかとなった。これらの化合物の幾つかは微小管の重合促進剤または重合阻害剤であった。この結果は微小管の正常な重合、解離が外来の異物排除に重要であり、その機能不全は著しい遺伝子導入の促進効果を持つことを示している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
スクリーニング系の構築に成功し、既知化合物から遺伝子導入効率に関わる因子として微小管を見出すことができた。今後新規化合物のスクリーニングを継続して行うことで、遺伝子導入促進剤を同定できる可能性があるだけなく、その作用点を明らかにすることで遺伝子導入効率制御の新規のメカニズムを解明する手掛かりを得られると考えている。平行して遺伝子導入時に形成されるp62の複合体の精製を試みている。遺伝子導入してから細胞を回収するタイミングや、導入する核酸の種類に応じて複合体の構成因子が変化するかを検討し、特異的な因子の同定を行うための準備を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
未同定化合物スクリーニングを進めるのに平行して、p62の制御因子もしくはp62の複合体構成因子の阻害剤に着目し、それらの薬剤がp62の機能阻害を起こすことによる遺伝子導入の促進がみられるかを検討する。ランダムなスクリーニングに加え構成因子の阻害剤検索を行うことで、遺伝子導入促進剤の同定の可能性を向上させることが可能となる。また構成因子については、siRNAまたはゲノム編集によってノックダウン、ノックアウトすることにより、遺伝子導入効率の高い細胞株の樹立が可能かを検討する。これらにより、最適な低分子化合物の探索のためのスクリーニングと並行し、それらの因子を標的とした化合物の検索にスクリーニング方法を試みることも可能である。
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| Causes of Carryover |
ハイスループットスクリーニングに必要な消耗品の生産が非常に遅れているため計画を一部変更し、生化学的な解析を平行してすすめた。消耗品の納期に目処が付き次第スクリーニングを再開する
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