2020 Fiscal Year Research-status Report
Functions and roles of proteases in dermatophyte infection mechanism
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20K07054
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
山田 剛 帝京大学, 付置研究所, 准教授 (80424331)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 章一 帝京大学, 公私立大学の部局等, 准教授 (40253695)
矢口 貴志 千葉大学, 真菌医学研究センター, 准教授 (60361440)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 皮膚糸状菌 / 皮膚真菌症 / プロテアーゼ / 生体防御回避 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
白癬の原因菌である皮膚糸状菌（以下、白癬菌）が表皮角質層に侵入・増殖し病態を形成するメカニズムに本菌由来の多様なプロテアーゼが密接に関与していると考えられている。例えば、白癬菌が産生する分泌型プロテアーゼや細胞表面に局在するプロテアーゼの中には、角質層を効率良く分解し、内部への侵入経路を確保するために利用されているものがあると考えられる。しかしながら、実際にこのようなプロセスへの関与が明確に示唆された分泌型プロテアーゼの報告は極めて少なく、「白癬の病態形成メカニズムにおける菌由来の分泌型プロテアーゼの役割とは？」という問いに対する知見は少ない。その一方で、研究代表者らは、白癬菌の菌糸から調製した細胞抽出液が表皮ケラチノサイトに与える影響の解析を通じて、「白癬菌由来のプロテアーゼが宿主の生体防御機構を制御（抑制）するサプレッサーのような働きをすることにより、宿主による排除の仕組みを巧みに逃れ、角質層内での持続的な発育を維持しているのではないか？”」という仮説を導き出した。白癬菌由来プロテアーゼに関するこれら2つの疑問・仮説に対する知見を得るべく、本研究を進めている。
研究開始年度である令和2年度は、白癬の病態形成メカニズムにおける白癬菌由来分泌型プロテアーゼの役割の解明に向けた研究を推進した。RNA-Seq解析によって、in vivo（動物感染モデル）における高レベルの遺伝子発現が確認（報告）されている一群（10個）の白癬菌由来分泌型プロテアーゼに着目し、「プロテアーゼをコードする遺伝子を1個～全て欠損させた白癬菌の変異株で構成されるライブラリーの構築」を押し進め、当初の計画通りプロテアーゼ遺伝子多重欠損株ライブラリーの構築を完了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究実績の概要で述べたように、本研究では、1. 白癬の病態形成メカニズムにおける白癬菌由来の分泌型プロテアーゼの役割に関する新たな知見を得る 2. 角質層内における白癬菌の持続的な発育維持のための菌由来プロテアーゼを介した宿主の生体防御機構の制御（抑制）の仕組み（プロテアーゼによる宿主の免疫応答回避機能）に関する知見を得る、以上2つの最終目標を掲げ、菌由来のプロテアーゼの解析を進めている。
令和2年度は、白癬の病態形成メカニズムにおける菌由来分泌型プロテアーゼの役割の解明に向けた研究を推進し、「10個の分泌型プロテアーゼをコードする遺伝子を1個～全て欠損させた変異株で構成されるライブラリーの構築」を完了した。現在、本ライブラリーを構成する多様な遺伝子欠損株を用いて、発育形態、総プロテアーゼ活性、ならびに欠損させたプロテアーゼと関連のある他の遺伝子〔in vitroで高発現するプロテアーゼ遺伝子、プロテアーゼの産生制御に関わる転写因子など〕の発現量に対する影響などの比較解析を進めているところである。
一方、白癬菌由来プロテアーゼによる宿主の免疫応答回避機能の仕組みに関する知見を得るための第一歩として令和2年度に予定していた「白癬菌の菌糸から調製した細胞抽出液による表皮ケラチノサイト（培養細胞）の細胞死の様式（ネクロシスまたはアポトーシス）を検証するための種々の解析（プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いた解析、ELIZA法を用いた解析）」については、新型コロナウイルス感染症の問題によって勤務形態に大幅な変更が生じたため、実施することができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度（令和3年度）は、以下の計画に沿って研究を推進していく。「白癬の病態形成メカニズムにおける菌由来の分泌型プロテアーゼの役割の解明」については、当初の計画通り、10個の分泌型プロテアーゼをコードする遺伝子の欠損株ライブラリーを用いて、発育形態、総プロテアーゼ活性、ならびに欠損させたプロテアーゼと関連のある他の遺伝子〔in vitroで高発現するプロテアーゼ遺伝子、プロテアーゼの産生制御に関わる転写因子など〕の発現量に対する影響などの比較解析を進める。これらの解析結果を踏まえた上で、動物感染モデルを用いたin vivoの実験に着手し、病態の経時変化などの比較解析を行う。
一方、「白癬菌由来プロテアーゼによる宿主の免疫応答回避機能の仕組み」に関する知見を得るための入り口として令和2年度に計画していた「白癬菌の菌糸から調製した細胞抽出液による表皮ケラチノサイト（培養細胞）の細胞死の様式（ネクロシスまたはアポトーシス）を検証するための種々の解析（プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いた解析、ELIZA法を用いた解析）」を実施し、得られた解析結果を踏まえて「表皮ケラチノサイトに誘導される細胞死の様式の解明、ならびに細胞死を誘導する分子（リガンド）及び細胞死を抑制する菌由来のプロテアーゼの解明」を目指す。
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| Causes of Carryover |
本研究には、1. 白癬の病態形成メカニズムにおける白癬菌由来の分泌型プロテアーゼの役割に関する新たな知見を得る 2. 角質層内における白癬菌の持続的な発育維持のための菌由来プロテアーゼを介した宿主の生体防御機構の制御（抑制）の仕組み（プロテアーゼによる宿主の免疫応答回避機能）に関する知見を得る、以上2つの最終目標がある。目標1に関連して研究課題申請時に計画した解析については、概ね計画通りに遂行することができ、関連する予算も計画通りに使用することができた。しかしながら、目標2に関連して研究課題申請時に設定をした解析については、新型コロナウイルス感染症が発生し、勤務形態に大幅な変更が生じたため、当該年度（令和2年度）中に実施することができず、関連する予算の使用に至らなかった。当該年度に実施できなかった解析については、現在次年度（令和3年度）の実施を計画しており、今回生じた次年度使用額は次年度（令和3年度）中に使用する予定である。
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